香菇条对胆固醇个体血脂异常和氧化应激的影响：随机研究

研究设计 该研究的主要结果是胆固醇血症，通过总胆固醇水平、甘油三酯或低密度脂蛋白 (LDL) 和高密度脂蛋白 (HDL) 进行评估。 次要结果包括血糖、体重指数 (BMI) 和氧化应激生物标志物。

2018 年 9 月至 2018 年 12 月进行了一项前瞻性 II 期、随机、双盲和安慰剂对照试验。 该研究在巴西圣保罗州索罗卡巴大学 (UNISO) 完成。 根据国家卫生委员会 (BRASIL, 2012) 和研究伦理审查委员会 (ERC) 的第 466/2012 号决议，索罗卡巴大学人类研究伦理委员会（方案编号 2.824.297）批准了该研究（附件 D） （世卫组织，2016 年）。

个人招募 对于个人招募，披露是在 II 期试验开始前五个月开始的。 该研究发表在索罗卡巴大学 (UNISO) 的网站上，分布在整个校园的社交媒体和文件夹上，其中包含对研究、纳入和排除标准以及研究人员联系方式的简要说明。 根据 Anvisa（国家卫生监督局）的 1.170 号决议，II 期研究不得少于 12 人；但是，该机构建议至少使用 24 名志愿者。

资格标准 共有 165 人完成了 Google 在线调查。

• 纳入标准 年龄在 20 至 65 岁之间，无论性别，至少有一项处于临界水平的以下生化标志物（总胆固醇 180 至 239 mg/dL；LDL 130 至 159 mg/dL；甘油三酯 150到 200 mg/dL)，被招募，通过生化检查诊断，日期最近到招募当天。 对酒吧成分和香菇有宽容度。 有空参加采血的日期和时间。
• 排除标准 然而，其中一些人患有癌症、心脏病、神经退行性疾病、糖尿病等疾病。 这些疾病可被视为研究的混杂因素，一些被招募的人必须被排除在外。 孕妇、哺乳期或激素替代妇女也不能参加。

在研究期间，个人被告知不要改变他们的饮食习惯和模式、身体活动水平或口服避孕药的使用，因此只确定了添加到饮食中的香菇对暴露组中每个人的影响。

研究干预。 该研究正式开始于 68 人，他们签署了知情同意书。 在第一次（时间 0 - T0）、第二次（时间 33 天 - T33）和第三次（时间 66 天 - T66）会议中，受试者接受了营养评估和病历，24 小时回忆饮食习惯和进食频率。

在研究的第一个月，生产了 4,100 根安慰剂或蘑菇棒，第二个月的产量为 3,500 根。 根据 Grotto 及其合作者（2015 年）的说法，进行了一项研究，评估不同的香菇浓度（100、400 和 800 mg/Kg/天）以确定动物的毒性程度。 100 毫克/千克/天的香菇浓度已被证明是安全的。 此外，在之前的研究中，香菇甜棒配方在感官分析和购买意向中得到认可。

随机化 个体 (68) 被随机分配（使用随机数表）到 2 组：I - 安慰剂组 (n = 32) 和 II - 干预组 (n = 36)。 为确保每天推荐的香菇摄入量为 100 mg/Kg/天，每位参与者都被加权以确定每天消耗的能量棒数量。

在进行营养评估和采血后，个体会收到一个身份不明的不透明密封包装，其中包含单独的真空棒，为期 T33 天。 患者和数据收集者都是盲人。 干预组和安慰剂组的巧克力棒在质地、风味、香气和外观上相似。

一个月后，所有个体都返回索罗卡巴大学进行新的营养评估，接受更多的食物棒和相同双盲护理 (T33) 的血液采集。 在六十六天 (T66) 结束时，受试者返回进行最后一次血液采集和最终营养评估。

生化分析 总胆固醇、LDL 胆固醇、HDL 胆固醇、甘油三酯和葡萄糖按照制造商的说明，在自动化设备 COBAS C111 (Roche®) 中根据以下方法通过商业试剂盒进行分析。

对于胆固醇，将 10 µL 样品和 1.0 mL 酶试剂在 37 ºC 下混合 10 分钟，通过脂蛋白脂肪酶将其完全转化为游离胆固醇。 该反应涉及胆固醇氧化酶将游离胆固醇氧化为胆固醇-3-酮和 H2O2。 并与过氧化物酶作用于苯酚与4-氨基安替比林形成樱桃色原体，颜色与胆固醇浓度成正比。

为了测定 HDL，用磷钨酸和氯化镁处理血清。 因此，在以 10.000 rpm 离心 2 分钟后，LDL 从级分中沉淀出来。 保留在上清液中的 HDL 根据胆固醇方法进行。 HDL浓度与颜色成正比。 通过从总胆固醇中减去 HDL 胆固醇来计算 LDL。

血清甘油三酯被脂蛋白脂肪酶水解为甘油和游离脂肪酸。 在三磷酸腺苷 (ATP) 和甘油激酶存在的情况下，甘油 3-磷酸被磷酸化，甘油磷酸氧化酶将其氧化为磷酸二氢丙酮和 H2O2。 H2O2、4-氨基安替比林和对氯苯酚在 37 ºC 水浴中通过过氧化物酶进行与上述相同的反应过程 10 分钟直至形成红色。

对于血糖测试，6-磷酸葡萄糖脱氢酶在 6-磷酸葡萄糖酸盐中存在 NADP 的情况下氧化 6-磷酸葡萄糖。 没有其他碳水化合物被氧化。 反应过程中 NADPH 的形成速率与葡萄糖浓度成正比，由光度法确定。

氧化应激分析 还原型谷胱甘肽 (GSH) 的测定是通过基于还原型总硫醇的定量来进行的。 为此，将 150 µL 血液与 100 µL 10% Triton X-100 和 100 µL 30% TCA 涡旋混合，然后以 4000 rpm 离心 10 分钟。 在比色杯中，吸取 900 µL 1M TFK、50 µL 上清液和 50 µL 10 mM DTNB，反应形成黄色复合物。 在分光光度计中在 412 nm 处读取读数。 为了计算浓度，使用了具有预定义 GSH 浓度（0.005；0.01；0.025；0.05；0.1 mM）的校准曲线。

为了评估过氧化氢酶的活性，基于过氧化氢酶对 H2O2 的分解，在 240 nm 处监测。 为此，将血液在 50 mM TFK 中稀释 60 倍。 将 20 μL 的等分试样与 1910 μL 相同的 TFK 混合，加入 70 μL H2O2，启动监测反应三分钟。 每分钟恒定的变化 (κ) 有助于过氧化氢酶 (κ/min) 的表达。

硫代巴比妥酸反应物质 (TBARS) 被用作脂质过氧化的生物标志物。 等分血浆 (150 µL) 与 50 µL NaOH 和 50 µL Milli-Q 超纯水（Direct 8，Millipore®）混合，并在 60 °C 下振荡孵育 30 分钟。 将 250 µL 6% H₃PO4、250 µL 0.8% TBA 和 100 µL 10% SDS 添加到样品中，并置于 80 °C 浴中一小时。 脂质过氧化物与 TBA 在酸性介质中反应形成粉红色化合物，并在 532 nm 的分光光度计中读取。 为了计算血浆中 TBARS 的浓度，绘制了主要硫代巴比妥酸反应物质丙二醛的校准曲线（0.28；0.56；1.7；3.4；6.6 µM）。