Effekter av Lentinula Edodes Bars på dyslipidemi och oxidativ stress hos kolesterolindivider: randomiserad studie

Studiedesign Det primära resultatet av studien var kolesterolemi, bedömd av totala kolesterolnivåer, triglycerider eller lågdensitetslipoproteiner (LDL) och högdensitetslipoproteiner (HDL). De sekundära resultaten inkluderade blodsocker, Body Mass Index (BMI) och biomarkörer för oxidativ stress.

En prospektiv fas II, randomiserad, dubbelblind och placebokontrollerad studie genomfördes från september 2018 till december 2018. Studien genomfördes vid University of Sorocaba (UNISO), delstaten São Paulo, Brasilien. Studien godkändes (bilaga D) av Human Research Ethics Committee från University of Sorocaba (protokollnummer 2.824.297), i enlighet med resolution 466/2012 från National Health Council (BRASIL, 2012) och Research Ethics Review Committee (ERC) (WHO, 2016).

Rekrytering av individer För rekrytering av individer initierades offentliggörandet fem månader innan fas II-studien påbörjades. Forskningen publicerades på webbplatsen för University of Sorocaba (UNISO), på sociala medier och mappar distribuerade över hela campus som innehåller en kort förklaring om forskningen, inkluderings- och uteslutningskriterier samt kontakt med forskaren. Enligt resolution 1.170, från Anvisa (National Health Surveillance Agency), är fas II-studier inte tillåtna med mindre än 12 personer; byrån föreslår dock att man använder minst 24 volontärer.

Behörighetskriterier Totalt 165 personer fyllde i Googles onlineundersökning.

• Inklusionskriterier Individer i åldern 20 till 65 år, av båda könen, som hade minst en av följande biokemiska markörer på gränsnivån (totalt kolesterol 180 till 239 mg/dL; LDL 130 till 159 mg/dL; triglycerider på 150 till 200 mg/dL), rekryterades, diagnostiserade genom biokemiska undersökningar med datum som är nyare än rekryteringsdagen. Var tolerant mot bars ingredienser och shiitake. Möjlighet att närvara vid datum och tid för blodinsamling.
• Uteslutningskriterier Vissa av dem hade dock sjukdomar som cancer, hjärtsjukdomar, neurodegenerativa sjukdomar, diabetes, bland annat. Dessa sjukdomar kunde betraktas som störande orsaker till studien och vissa rekryterade personer måste uteslutas. Gravida, ammande eller hormonersättande kvinnor kunde inte heller delta.

Individer instruerades att inte ändra sina matvanor och mönster, fysisk aktivitetsnivå eller användning av orala preventivmedel under studien, och identifierade således endast effekterna av shiitake som lagts till kosten för varje individ på den exponerade gruppen.

Studieinterventioner. Studien startade officiellt med 68 personer, som undertecknade ett informerat samtycke. I det första (Tid 0 - T0), i det andra (Tid 33 dagar - T33) och i det tredje (Tid 66 dagar - T66) mötet underkastades försökspersonerna näringsbedömning och anamnes, 24-timmars återkallande av matvanor och ätfrekvens.

Under den första månaden av studien producerades 4 100 placebo- eller svampstänger och under den andra månaden var produktionen 3 500 barer. Enligt Grotto och medarbetare (2015), genomförde en studie som utvärderade olika shiitake-koncentrationer (100, 400 och 800 mg/kg/dag) för att bestämma graden av toxicitet hos djur. Shiitake-koncentration på 100 mg/kg/dag har visat sig vara säker. Dessutom godkändes Shiitake sweet bar-formuleringen i den sensoriska analysen och köpavsikten i den tidigare studien.

Randomisering Individerna (68) fördelades slumpmässigt (med hjälp av en tabell med slumpmässiga siffror) i 2 grupper: I - Placebogrupp (n = 32) och II - Interventionsgrupp (n = 36). För att säkerställa det dagliga rekommenderade intaget av Shiitake på 100 mg/kg/dag, viktades varje deltagare för att bestämma antalet barer som konsumerades per dag.

Individerna fick efter näringsbedömning och blodinsamling en oidentifierad ogenomskinlig och förseglad förpackning innehållande individuella vakuumstänger under en period av T33 dagar. Patienterna och datainsamlaren var blinda. Staplarna i interventions- och placebogruppen var likartade i textur, smak, arom och utseende.

Efter en månad återvände alla individer till University of Sorocaba för nya näringsbedömningar, och fick fler matkakor och blodinsamling med samma dubbelblinda vård (T33). I slutet av sextiosex dagar (T66) återvände försökspersonerna för den sista blodinsamlingen och slutliga näringsbedömningen.

Biokemisk analys Totalkolesterol, LDL-kolesterol, HDL-kolesterol, triglycerider och glukos analyserades med kommersiella kit, enligt tillverkarens specifikationer, i den automatiserade utrustningen COBAS C111 (Roche®) enligt metoderna nedan.

För kolesterol blandades 10 µL prov och 1,0 ml enzymreagens vid 37 ºC i 10 minuter för total omvandling till fritt kolesterol med lipoproteinlipasenzym. Reaktionen involverade oxidation av fritt kolesterol till kolesterol-3-on och H2O2 av kolesteroloxidasenzymet. Och med verkan av peroxidas på fenol med 4-aminoantipyrin bildade en körsbärskromogen, färgen är proportionell mot koncentrationen av kolesterol.

För bestämning av HDL behandlades serumet med fosfovolframatsyra och magnesiumklorid. Så, LDL fälldes ut från fraktionen efter centrifugering under 2 minuter vid 10 000 rpm. HDL, som fanns kvar i supernatanten, utfördes enligt kolesterolmetodologin. HDL-koncentrationen är proportionell mot färgen. LDL beräknades genom att subtrahera HDL-kolesterol från totalkolesterol.

Serumtriglycerider hydrolyserades till glycerol och fri fettsyra med lipoproteinlipas. I närvaro av adenosintrifosfat (ATP) och glycerolkinas, fosforylerades glycerol-3-fosfat, som oxiderades till acetondivätefosfat och H2O2 av glycerolfosfatoxidaset. H2O2, 4-aminoantipyrin och p-klorfenol genomgick samma reaktionsprocess som rapporterats ovan med peroxidas i ett 37 ºC vattenbad under 10 minuter tills röd färg bildades.

För blodsockertestet oxiderade glukos-6-fosfatdehydrogenas glukos-6-fosfat i närvaro av NADP i glukonat-6-fosfat. Inga andra kolhydrater har oxiderats. Hastigheten för NADPH-bildning under reaktionen var direkt proportionell mot glukoskoncentrationen, vilken bestämdes fotometriskt.

Oxidativ stressanalys Bestämningen av reducerat glutation (GSH) gjordes genom kvantifiering av reducerade totala tioler. För detta virvlades 150 µL av blodet med 100 µL 10 % Triton X-100 och 100 µL 30 % TCA, och centrifugerades sedan i 10 minuter vid 4000 rpm. I kyvetten pipetterades 900 µL 1 M TFK, 50 µL supernatant och 50 µL 10 mM DTNB, som reagerade för att bilda ett gult komplex. Avläsningen gjordes vid 412 nm i en spektrofotometer. För beräkning av koncentrationen användes kalibreringskurvan med fördefinierade GSH-koncentrationer (0,005; 0,01; 0,025; 0,05; 0,1 mM).

För att utvärdera aktiviteten av katalasenzym användes, baserat på nedbrytningen av H2O2 genom katalas, övervakad vid 240 nm. För detta späddes blodet 60 gånger i 50 mM TFK. En alikvot på 20 μL blandades till 1910 μL av samma TFK och 70 μL H2O2 tillsattes, vilket initierade den övervakade reaktionen i tre minuter. En variationskonstant (k) per minut hjälpte till vid uttrycket av katalasenzym (k/min).

Tiobarbitursyrareaktiva substanser (TBARS) användes som en biomarkör för lipidperoxidation. Plasmaalikvoter (150 µL) blandades med 50 µL NaOH och 50 µL Milli-Q ultrarent vatten (Direct 8, Millipore®) och inkuberades vid 60 °C under 30 minuter under skakning. 250 ul 6 % H3PO4, 250 ul 0,8 % TBA och 100 ul 10 % SDS sattes till proverna och togs till 80°C-badet under en timme. Lipidperoxider reagerade med TBA i surt medium för att bilda en rosa förening och avlästes i en spektrofotometer vid 532 nm. För att beräkna koncentrationen av TBARS i plasma gjordes en kalibreringskurva för malondialdehyd, den huvudsakliga tiobarbitursyrareaktiva substansen (0,28; 0,56; 1,7; 3,4; 6,6 µM).