Efeitos das Barras de Lentinula Edodes na Dislipidemia e Estresse Oxidativo em Indivíduos com Colesterol: Estudo Randomizado

Desenho do estudo O desfecho primário do estudo foi a colesterolemia, avaliada pelos níveis de colesterol total, triglicerídeos ou lipoproteínas de baixa densidade (LDL) e lipoproteínas de alta densidade (HDL). Os desfechos secundários incluíram glicemia, Índice de Massa Corporal (IMC) e biomarcadores de estresse oxidativo.

Um estudo prospectivo de Fase II, randomizado, duplo-cego e controlado por placebo foi conduzido de setembro de 2018 a dezembro de 2018. O estudo foi realizado na Universidade de Sorocaba (UNISO), Estado de São Paulo, Brasil. O estudo foi aprovado (Anexo D) pelo Comitê de Ética em Pesquisa com Seres Humanos da Universidade de Sorocaba (protocolo número 2.824.297), de acordo com a Resolução 466/2012 do Conselho Nacional de Saúde (BRASIL, 2012) e Comitê de Ética em Pesquisa (CRE). (OMS, 2016).

Recrutamento de indivíduos Para o recrutamento de indivíduos, a divulgação foi iniciada cinco meses antes do início do ensaio de Fase II. A pesquisa foi divulgada no site da Universidade de Sorocaba (UNISO), nas redes sociais e folders distribuídos pelo campus contendo uma breve explicação sobre a pesquisa, critérios de inclusão e exclusão e contato do pesquisador. De acordo com a Resolução 1.170, da Anvisa (Agência Nacional de Vigilância Sanitária), não são permitidos estudos de Fase II com menos de 12 pessoas; no entanto, a Agência sugere o uso de um mínimo de 24 voluntários.

Critérios de elegibilidade Um total de 165 pessoas respondeu à pesquisa on-line do Google.

• Critérios de Inclusão Indivíduos de 20 a 65 anos, de ambos os sexos, que apresentassem pelo menos um dos seguintes marcadores bioquímicos em nível limítrofe (colesterol total 180 a 239 mg/dL; LDL 130 a 159 mg/dL; triglicerídeos de 150 a 200 mg/dL), foram recrutados, diagnosticados por exames bioquímicos com datas recentes ao dia do recrutamento. O ser tolerante aos ingredientes das barras e ao Shiitake. Disponibilidade para comparecer no dia e horário da coleta de sangue.
• Critérios de Exclusão No entanto, alguns deles apresentavam doenças como câncer, doenças cardíacas, doenças neurodegenerativas, diabetes, entre outras. Essas doenças podem ser consideradas fatores de confusão do estudo e algumas pessoas recrutadas tiveram que ser excluídas. Grávidas, lactantes ou em reposição hormonal também não poderiam participar.

Os indivíduos foram orientados a não alterar seus hábitos e padrões alimentares, nível de atividade física ou uso de anticoncepcional oral durante o estudo, identificando assim apenas os efeitos do Shiitake adicionado à dieta para cada indivíduo do grupo exposto.

Intervenções do Estudo. O estudo começou oficialmente com 68 indivíduos, que assinaram um termo de consentimento informado. No primeiro (Tempo 0 - T0), no segundo (Tempo 33 dias - T33) e no terceiro (Tempo 66 dias - T66) encontros, os sujeitos foram submetidos à avaliação nutricional e anamnese, recordatório de 24 horas de hábitos alimentares e frequência alimentar.

No primeiro mês do estudo foram produzidas 4.100 barras de placebo ou cogumelos e no segundo mês a produção foi de 3.500 barras. Segundo Grotto e colaboradores (2015), realizaram um estudo avaliando diferentes concentrações de Shiitake (100, 400 e 800 mg/Kg/dia) para determinar o grau de toxicidade em animais. A concentração de Shiitake de 100 mg/Kg/dia tem se mostrado segura. Além disso, a formulação da barra doce Shiitake foi aprovada na análise sensorial e intenção de compra no estudo anterior.

Randomização Os indivíduos (68) foram alocados aleatoriamente (por meio de uma tabela de números aleatórios) em 2 grupos: I - Grupo placebo (n = 32) e II - Grupo intervenção (n = 36). Para garantir a ingestão diária recomendada de Shiitake de 100 mg/Kg/dia, cada participante foi pesado para determinar o número de barras consumidas por dia.

Os Indivíduos após avaliação nutricional e coleta de sangue, receberam um opaco não identificado e embalado lacrado contendo barras a vácuo individualmente por um período de T33 dias. Os pacientes e o coletor de dados eram cegos. As barras dos grupos intervenção e placebo foram semelhantes em textura, sabor, aroma e aparência.

Após um mês, todos os indivíduos retornaram à Universidade de Sorocaba para novas avaliações nutricionais, recebendo mais barras alimentares e coleta de sangue com o mesmo atendimento duplo-cego (T33). Ao final de sessenta e seis dias (T66), os indivíduos retornaram para a última coleta de sangue e avaliação nutricional final.

Análise Bioquímica Colesterol total, colesterol LDL, colesterol HDL, triglicerídeos e glicose foram analisados ​​por kits comerciais, seguindo as especificações do fabricante, no equipamento automatizado COBAS C111 (Roche®) conforme as metodologias abaixo.

Para o colesterol, 10 µL de amostra e 1,0 mL de reagente enzimático foram misturados a 37 ºC por 10 min para transformação total em colesterol livre, pela enzima lipoproteína lipase. A reação envolveu a oxidação do colesterol livre em colesterol-3-ona e H2O2 pela enzima colesterol oxidase. E com a ação da peroxidase sobre o fenol com 4-aminoantipirina formou-se um cromogênio cereja, sendo a cor proporcional à concentração de colesterol.

Para a determinação de HDL, o soro foi tratado com ácido fosfotungstato e cloreto de magnésio. Assim, o LDL foi precipitado da fração após centrifugação por 2 min a 10.000 rpm. O HDL, que permaneceu no sobrenadante, foi realizado de acordo com a metodologia do colesterol. A concentração de HDL é proporcional à cor. O LDL foi calculado subtraindo o colesterol HDL do colesterol total.

Os triglicerídeos séricos foram hidrolisados ​​em glicerol e ácido graxo livre pela lipoproteína lipase. Na presença de adenosina trifosfato (ATP) e glicerol quinase, o glicerol-3-fosfato foi fosforilado, o qual foi oxidado a acetona dihidrogenofosfato e H2O2 pela glicerol fosfato oxidase. H2O2, 4-aminoantipirina e p-clorofenol sofreram o mesmo processo de reação descrito acima pela peroxidase em banho-maria a 37 ºC por 10 minutos até formação da coloração vermelha.

Para o teste de glicose no sangue, a glicose-6-fosfato desidrogenase oxidou a glicose-6-fosfato na presença de NADP em gluconato-6-fosfato. Nenhum outro carboidrato foi oxidado. A taxa de formação de NADPH durante a reação foi diretamente proporcional à concentração de glicose, sendo determinada fotometricamente.

Análise de Estresse Oxidativo A determinação de glutationa reduzida (GSH) foi feita pela quantificação baseada em tióis totais reduzidos. Para isso, 150 µL do sangue foram agitados com 100 µL 10% Triton X-100 e 100 µL 30% TCA, depois centrifugados por 10 min a 4000 rpm. Na cubeta foram pipetados 900 µL de 1M TFK, 50 µL de sobrenadante e 50 µL de 10 mM DTNB, que reagiu para formar um complexo amarelo. A leitura foi feita a 412 nm em um espectrofotômetro. Para o cálculo da concentração, foi utilizada a curva de calibração com concentrações pré-definidas de GSH (0,005; 0,01; 0,025; 0,05; 0,1 mM).

Para avaliar a atividade da enzima catalase foi utilizada, com base na decomposição do H2O2 pela catalase, monitorada a 240 nm. Para isso, o sangue foi diluído 60 vezes em 50 mM TFK. Uma alíquota de 20 μL foi misturada a 1910 μL do mesmo TFK, e 70 μL de H2O2 foram adicionados, iniciando a reação monitorada por três minutos. Uma constante de variação (κ) por minuto auxiliou na expressão da enzima catalase (κ/min).

Substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) foram utilizadas como biomarcador da peroxidação lipídica. Alíquotas de plasma (150 µL) foram misturadas com 50 µL de NaOH e 50 µL de água ultrapura Milli-Q (Direct 8, Millipore®) e incubadas a 60 °C por 30 minutos com agitação. 250 µL de H3PO4 a 6%, 250 µL de TBA a 0,8% e 100 µL de SDS a 10% foram adicionados às amostras e levados ao banho a 80 °C durante uma hora. Peróxidos lipídicos reagiram com TBA em meio ácido para formar um composto rosa e ler em um espectrofotômetro a 532 nm. Para calcular a concentração de TBARS no plasma, uma curva de calibração de malondialdeído, a principal substância reativa do ácido tiobarbitúrico, foi feita (0,28; 0,56; 1,7; 3,4; 6,6 µM).