Влияние батончиков Lentinula Edodes на дислипидемию и окислительный стресс у людей с холестерином: рандомизированное исследование

Дизайн исследования Первичным результатом исследования была холестеринемия, оцениваемая по уровням общего холестерина, триглицеридов или липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) и липопротеинов высокой плотности (ЛПВП). Вторичные результаты включали уровень глюкозы в крови, индекс массы тела (ИМТ) и биомаркеры окислительного стресса.

Проспективное рандомизированное, двойное слепое и плацебо-контролируемое исследование фазы II проводилось с сентября 2018 года по декабрь 2018 года. Исследование проведено в Университете Сорокабы (UNISO), штат Сан-Паулу, Бразилия. Исследование было одобрено (Приложение D) Комитетом по этике исследований на людях Университета Сорокабы (номер протокола 2.824.297) в соответствии с Резолюцией 466/2012 Национального совета здравоохранения (BRASIL, 2012 г.) и Комитетом по обзору этики исследований (ERC). (ВОЗ, 2016 г.).

Вербовка лиц Раскрытие информации о вербовке лиц было начато за пять месяцев до начала испытаний Фазы II. Исследование было опубликовано на веб-сайте Университета Сорокабы (UNISO), в социальных сетях и в папках, распространенных по кампусу, с кратким объяснением исследования, критериями включения и исключения и контактной информацией исследователя. Согласно Резолюции 1.170 от Anvisa (Национальное агентство по надзору за здоровьем), исследования фазы II не допускаются с участием менее 12 человек; однако Агентство предлагает использовать как минимум 24 добровольца.

Критерии отбора Всего в онлайн-опросе Google приняли участие 165 человек.

• Критерии включения Лица в возрасте от 20 до 65 лет, обоего пола, имеющие хотя бы один из следующих биохимических маркеров на пограничном уровне (общий холестерин от 180 до 239 мг/дл; ЛПНП от 130 до 159 мг/дл; триглицериды 150 до 200 мг/дл), были завербованы, диагностированы биохимическими исследованиями с датами, недавними в день набора. Будьте терпимы к ингредиентам батончиков и шиитаке. Возможность присутствия на дату и время забора крови.
• Критерии исключения Однако у некоторых из них были такие заболевания, как рак, болезни сердца, нейродегенеративные заболевания, диабет и другие. Эти заболевания можно было рассматривать как факторы, вмешивающиеся в исследование, и некоторых набранных людей пришлось исключить. Беременные, кормящие женщины или женщины, заменяющие гормоны, также не могли участвовать.

Людей проинструктировали не менять свои привычки и модели питания, уровень физической активности или использование оральных контрацептивов во время исследования, таким образом определяя только эффекты шиитаке, добавленного в рацион для каждого человека в группе, подвергшейся воздействию.

Учебные вмешательства. Исследование официально началось с 68 человек, подписавших информированное согласие. В первой (Время 0 - Т0), во второй (Время 33 дня - Т33) и в третьей (Время 66 дней - Т66) встречах испытуемых подвергали оценке питания и анамнезу, 24-часовому воспоминанию пищевых привычек. и частота приема пищи.

В первый месяц исследования было произведено 4100 плацебо или грибных батончиков, а во второй месяц — 3500 батончиков. По словам Грота и соавторов (2015), было проведено исследование по оценке различных концентраций шиитаке (100, 400 и 800 мг/кг/день) для определения степени токсичности у животных. Доказано, что концентрация шиитаке 100 мг/кг/день безопасна. Кроме того, рецептура сладкого батончика шиитаке была одобрена в ходе органолептического анализа и намерения совершить покупку в предыдущем исследовании.

Рандомизация Индивидуумы (68 человек) были случайным образом распределены (с использованием таблицы случайных чисел) на 2 группы: I - группа плацебо (n = 32) и II - группа вмешательства (n = 36). Чтобы обеспечить рекомендуемую ежедневную дозу шиитаке 100 мг/кг/день, каждого участника взвешивали, чтобы определить количество батончиков, потребляемых в день.

Индивидуумы после оценки питания и сбора крови получали неидентифицированную непрозрачную и запечатанную упаковку, содержащую отдельные вакуумные стержни, на период T33 дня. Пациенты и сборщик данных были слепы. Батончики групп вмешательства и плацебо были похожи по текстуре, вкусу, аромату и внешнему виду.

Через месяц все люди вернулись в Университет Сорокабы для новой оценки питания, получили больше пищевых батончиков и забор крови с одинаковым двойным слепым лечением (T33). По истечении шестидесяти шести дней (Т66) субъекты возвращались для последнего сбора крови и окончательной оценки питания.

Биохимический анализ Общий холестерин, холестерин ЛПНП, холестерин ЛПВП, триглицериды и глюкозу анализировали с помощью коммерческих наборов, следуя спецификациям производителя, на автоматизированном оборудовании COBAS C111 (Roche®) в соответствии с приведенными ниже методологиями.

Для холестерина 10 мкл образца и 1,0 мл ферментного реагента смешивали при 37 ºC в течение 10 минут для полного превращения в свободный холестерин ферментом липопротеинлипазой. Реакция включала окисление свободного холестерина до холестерина-3-она и H2O2 ферментом холестериноксидазой. А при действии пероксидазы на фенол с 4-аминоантипирином образуется вишневый хромоген, окраска которого пропорциональна концентрации холестерина.

Для определения ЛПВП сыворотку обрабатывали фосфорно-вольфрамовой кислотой и хлоридом магния. Так, ЛПНП осаждался из фракции после центрифугирования в течение 2 мин при 10 000 об/мин. ЛПВП, которые остались в супернатанте, определяли по холестериновой методике. Концентрация ЛПВП пропорциональна цвету. ЛПНП рассчитывали путем вычитания холестерина ЛПВП из общего холестерина.

Триглицериды сыворотки гидролизовали до глицерина и свободных жирных кислот под действием липопротеинлипазы. В присутствии аденозинтрифосфата (АТФ) и глицеролкиназы фосфорилировался глицерол-3-фосфат, который окислялся до ацетондигидрофосфата и Н2О2 под действием глицеролфосфатоксидазы. H2O2, 4-аминоантипирин и п-хлорфенол подвергались той же реакции, описанной выше, с пероксидазой на водяной бане при 37 ºC в течение 10 минут до образования красного цвета.

Для теста на глюкозу крови глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа окисляла глюкозо-6-фосфат в присутствии НАДФ в глюконат-6-фосфат. Никакие другие углеводы не окисляются. Скорость образования НАДФН в ходе реакции была прямо пропорциональна концентрации глюкозы и определялась фотометрически.

Анализ окислительного стресса Определение восстановленного глутатиона (GSH) проводили путем количественного определения восстановленных общих тиолов. Для этого 150 мкл крови вортексировали со 100 мкл 10% Тритона Х-100 и 100 мкл 30% ТХУ, затем центрифугировали 10 мин при 4000 об/мин. В кювету пипетировали 900 мкл 1М ТФК, 50 мкл супернатанта и 50 мкл 10 мМ ДТНБ, которые реагировали с образованием желтого комплекса. Показания снимали при 412 нм на спектрофотометре. Для расчета концентрации использовали калибровочную кривую с заданными концентрациями GSH (0,005; 0,01; 0,025; 0,05; 0,1 мМ).

Для оценки активности каталазы использовали фермент, основанный на разложении H2O2 каталазой, контролируемом при 240 нм. Для этого кровь разводили в 60 раз в 50 мМ ТФК. Аликвоту 20 мкл смешивали с 1910 мкл той же ТФК и добавляли 70 мкл H2O2, инициируя контролируемую реакцию на три минуты. Константа вариации (κ) в минуту помогала экспрессии фермента каталазы (κ/мин).

В качестве биомаркера перекисного окисления липидов использовали вещества, реагирующие с тиобарбитуровой кислотой (ТБКР). Аликвоты плазмы (150 мкл) смешивали с 50 мкл NaOH и 50 мкл сверхчистой воды Milli-Q (Direct 8, Millipore®) и инкубировали при 60 °C в течение 30 минут при встряхивании. К образцам добавляли 250 мкл 6% H3PO4, 250 мкл 0,8% ТБК и 100 мкл 10% SDS и помещали в ванну с температурой 80°C на один час. Пероксиды липидов реагировали с ТВА в кислой среде с образованием соединения розового цвета и считывались на спектрофотометре при 532 нм. Для расчета концентрации ТБАРС в плазме строили калибровочную кривую малонового диальдегида, основного реактивного вещества тиобарбитуровой кислоты (0,28; 0,56; 1,7; 3,4; 6,6 мкМ).