Účinky tyčinek Lentinula Edodes na dyslipidémii a oxidační stres u jedinců s cholesterolem: Randomizovaná studie

Uspořádání studie Primárním výsledkem studie byla cholesterolémie, hodnocená hladinami celkového cholesterolu, triglyceridů nebo lipoproteinů s nízkou hustotou (LDL) a lipoproteinů s vysokou hustotou (HDL). Sekundární výsledky zahrnovaly glykémii, index tělesné hmotnosti (BMI) a biomarkery oxidačního stresu.

Prospektivní fáze II, randomizovaná, dvojitě zaslepená a placebem kontrolovaná studie byla provedena od září 2018 do prosince 2018. Studie byla provedena na University of Sorocaba (UNISO), stát São Paulo, Brazílie. Studie byla schválena (příloha D) Etickou komisí pro lidský výzkum z University of Sorocaba (protokol číslo 2.824.297), v souladu s rezolucí 466/2012 Národní zdravotní rady (BRASIL, 2012) a Research Ethics Review Committee (ERC) (WHO, 2016).

Nábor jednotlivců Pro nábor jednotlivců bylo zveřejnění zahájeno pět měsíců před zahájením fáze II studie. Výzkum byl zveřejněn na webových stránkách University of Sorocaba (UNISO), na sociálních sítích a ve složkách rozmístěných po kampusu, které obsahovaly stručné vysvětlení výzkumu, kritéria pro zařazení a vyloučení a kontakt na výzkumníka. Podle rezoluce 1.170 společnosti Anvisa (Národní agentura pro dohled nad zdravím) nejsou studie fáze II povoleny s méně než 12 lidmi; Agentura však navrhuje využít minimálně 24 dobrovolníků.

Kritéria způsobilosti Online průzkum Google vyplnilo celkem 165 jednotlivců.

• Kritéria pro zařazení Jedinci ve věku od 20 do 65 let, obou pohlaví, kteří měli alespoň jeden z následujících biochemických markerů na hraniční úrovni (celkový cholesterol 180 až 239 mg/dl; LDL 130 až 159 mg/dl; triglyceridy 150 do 200 mg/dl), byli přijati, diagnostikováni biochemickými vyšetřeními s daty nedávnými ke dni náboru. Buďte tolerantní k přísadám tyčinek a shiitake. Možnost zúčastnit se datum a čas odběru krve.
• Kritéria vyloučení Někteří z nich však měli mimo jiné onemocnění, jako je rakovina, srdeční onemocnění, neurodegenerativní onemocnění, cukrovka. Tyto nemoci by mohly být považovány za zmatky ve studii a někteří rekrutovaní lidé museli být vyloučeni. Nemohly se zúčastnit ani těhotné, kojící ženy nebo ženy s hormonální substitucí.

Jednotlivci byli instruováni, aby během studie neměnili své stravovací návyky a vzorce, úroveň fyzické aktivity nebo užívání orální antikoncepce, a tak identifikovali pouze účinky Shiitake přidané do stravy pro každého jednotlivce v exponované skupině.

Studijní intervence. Studie oficiálně začala s 68 jednotlivci, kteří podepsali informovaný souhlas. Na prvním (Čas 0 - T0), na druhém (Čas 33 dní - T33) a na třetím (Čas 66 dní - T66) setkání byly subjekty podrobeny nutričnímu posouzení a anamnéze, 24hodinovému vybavování stravovacích návyků a frekvence jídla.

V prvním měsíci studie bylo vyrobeno 4 100 placeba nebo houbových tyčinek a ve druhém měsíci byla produkce 3 500 tyčinek. Podle Grotto and collaborators (2015) provedli studii hodnotící různé koncentrace shiitake (100, 400 a 800 mg/kg/den), aby určili stupeň toxicity u zvířat. Koncentrace shiitake 100 mg/kg/den se ukázala jako bezpečná. Kromě toho složení sladké tyčinky Shiitake bylo schváleno v rámci senzorické analýzy a záměru nákupu v předchozí studii.

Randomizace Jednotlivci (68) byli náhodně rozděleni (pomocí tabulky náhodných čísel) do 2 skupin: I - skupina s placebem (n = 32) a II - skupina s intervencí (n = 36). Aby byl zajištěn denní doporučený příjem shiitake 100 mg/kg/den, byl každý účastník zvážen, aby se určil počet tyčinek zkonzumovaných za den.

Jednotlivci po nutričním posouzení a odběru krve obdrželi neidentifikovaný neprůhledný a zapečetěný obal obsahující jednotlivé vakuové tyčinky po dobu T33 dnů. Pacienti a sběratel dat byli slepí. Tyčinky intervenčních a placebových skupin byly podobné texturou, chutí, vůní a vzhledem.

Po jednom měsíci se všichni jedinci vrátili na University of Sorocaba k novým nutričním hodnocením, dostali více potravinových tyčinek a odběr krve se stejnou dvojitě zaslepenou péčí (T33). Na konci šedesáti šesti dnů (T66) se subjekty vrátily k poslednímu odběru krve a konečnému nutričnímu hodnocení.

Biochemická analýza Celkový cholesterol, LDL cholesterol, HDL cholesterol, triglyceridy a glukóza byly analyzovány komerčními soupravami podle specifikací výrobce v automatizovaném zařízení COBAS C111 (Roche®) podle níže uvedených metodologií.

V případě cholesterolu bylo 10 ul vzorku a 1,0 ml enzymového činidla smícháno při 37 °C po dobu 10 minut pro celkovou transformaci na volný cholesterol enzymem lipoprotein lipázou. Reakce zahrnovala oxidaci volného cholesterolu na cholesterol-3-on a H2O2 enzymem cholesteroloxidázou. A působením peroxidázy na fenol s 4-aminoantipyrinem vznikl třešňový chromogen, jehož barva je úměrná koncentraci cholesterolu.

Pro stanovení HDL bylo sérum ošetřeno kyselinou fosfowolframovou a chloridem hořečnatým. LDL se tedy vysrážel z frakce po centrifugaci po dobu 2 minut při 10 000 ot./min. HDL, který zůstal v supernatantu, byl proveden podle cholesterolové metodiky. Koncentrace HDL je úměrná barvě. LDL byl vypočten odečtením HDL cholesterolu od celkového cholesterolu.

Sérové ​​triglyceridy byly hydrolyzovány na glycerol a volnou mastnou kyselinu pomocí lipoproteinové lipázy. V přítomnosti adenosintrifosfátu (ATP) a glycerolkinázy byl fosforylován glycerol-3-fosfát, který byl oxidován glycerolfosfátoxidázou na acetondihydrogenfosfát a H2O2. H2O2, 4-aminoantipyrin a p-chlorfenol prošly stejným výše uvedeným reakčním procesem peroxidázou ve vodní lázni o teplotě 37 ºC po dobu 10 minut do vytvoření červeného zbarvení.

Pro krevní test glukózy oxidovala glukóza-6-fosfátdehydrogenáza glukóza-6-fosfát v přítomnosti NADP v glukonát-6-fosfátu. Žádné jiné sacharidy nebyly oxidovány. Rychlost tvorby NADPH během reakce byla přímo úměrná koncentraci glukózy, která byla stanovena fotometricky.

Analýza oxidačního stresu Stanovení redukovaného glutathionu (GSH) bylo provedeno kvantifikací na základě redukovaných celkových thiolů. Za tímto účelem bylo 150 ul krve vortexováno se 100 ul 10% Triton X-100 a 100 ul 30% TCA, poté centrifugováno po dobu 10 minut při 4000 ot./min. Do kyvety bylo odpipetováno 900 ul 1M TFK, 50 ul supernatantu a 50 ul 10 mM DTNB, které reagovaly za vzniku žlutého komplexu. Odečet byl proveden při 412 nm na spektrofotometru. Pro výpočet koncentrace byla použita kalibrační křivka s předem definovanými koncentracemi GSH (0,005; 0,01; 0,025; 0,05; 0,1 mM).

K hodnocení aktivity enzymu katalázy byl použit enzym na základě rozkladu H2O2 katalázou, monitorovaný při 240 nm. Za tímto účelem byla krev zředěna 60krát v 50 mM TFK. Alikvot 20 μl byl smíchán s 1910 μl stejného TFK a bylo přidáno 70 μl H2O2, čímž byla zahájena monitorovaná reakce po dobu tří minut. Variační konstanta (K) za minutu pomáhala při expresi enzymu katalázy (K/min).

Jako biomarker peroxidace lipidů byly použity látky reaktivní s kyselinou thiobarbiturovou (TBARS). Alikvoty plazmy (150 ul) byly smíchány s 50 ul NaOH a 50 ul Milli-Q ultračisté vody (Direct 8, Millipore®) a inkubovány při 60 °C po dobu 30 minut za třepání. Ke vzorkům bylo přidáno 250 ul 6% H3P04, 250 ul 0,8% TBA a 100 ul 10% SDS a uloženo do lázně o teplotě 80 °C po dobu jedné hodiny. Lipidové peroxidy reagovaly s TBA v kyselém prostředí za vzniku růžové sloučeniny a odečítaly se na spektrofotometru při 532 nm. Pro výpočet koncentrace TBARS v plazmě byla vytvořena kalibrační křivka malondialdehydu, hlavní látky reaktivní s thiobarbiturovou kyselinou (0,28; 0,56; 1,7; 3,4; 6,6 uM).