Effetti delle barrette di Lentinula Edodes sulla dislipidemia e sullo stress ossidativo nei soggetti con colesterolo: studio randomizzato

Disegno dello studio L'esito primario dello studio era la colesterolemia, valutata dai livelli di colesterolo totale, trigliceridi o lipoproteine ​​a bassa densità (LDL) e lipoproteine ​​ad alta densità (HDL). Gli esiti secondari includevano glicemia, indice di massa corporea (BMI) e biomarcatori dello stress ossidativo.

Da settembre 2018 a dicembre 2018 è stato condotto uno studio prospettico di fase II, randomizzato, in doppio cieco e controllato con placebo. Lo studio è stato realizzato presso l'Università di Sorocaba (UNISO), Stato di San Paolo, Brasile. Lo studio è stato approvato (Allegato D) dal Comitato Etico della Ricerca Umana dell'Università di Sorocaba (protocollo numero 2.824.297), in conformità con la Risoluzione 466/2012 del Consiglio Sanitario Nazionale (BRASIL, 2012) e il Comitato di Revisione Etica della Ricerca (ERC). (OMS, 2016).

Reclutamento di individui Per il reclutamento di individui, la divulgazione è stata avviata cinque mesi prima dell'inizio della fase II del processo. La ricerca è stata pubblicata sul sito web dell'Università di Sorocaba (UNISO), sui social media e cartelle distribuite in tutto il campus contenenti una breve spiegazione sulla ricerca, sui criteri di inclusione ed esclusione e sul contatto del ricercatore. Secondo la Delibera 1.170, dell'Anvisa (Agenzia nazionale di sorveglianza sanitaria), non sono consentiti gli studi di Fase II con meno di 12 persone; tuttavia, l'Agenzia suggerisce di utilizzare un minimo di 24 volontari.

Criteri di idoneità Un totale di 165 persone ha completato il sondaggio online di Google.

• Criterio di inclusione Soggetti di età compresa tra 20 e 65 anni, di entrambi i sessi, che presentavano almeno uno dei seguenti marcatori biochimici a livello borderline (colesterolo totale da 180 a 239 mg/dL; LDL da 130 a 159 mg/dL; trigliceridi da 150 a 200 mg/dL), sono stati reclutati, diagnosticati da esami biochimici con data recente al giorno del reclutamento. Sii tollerante agli ingredienti delle barrette e allo Shiitake. Disponibilità a partecipare alla data e all'ora del prelievo del sangue.
• Criteri di esclusione Tuttavia, alcuni di loro avevano malattie come cancro, malattie cardiache, malattie neurodegenerative, diabete, tra gli altri. Queste malattie potrebbero essere considerate fattori confondenti dello studio e alcune persone reclutate dovevano essere escluse. Nemmeno le donne incinte, in allattamento o sostitutive di ormoni potevano partecipare.

Gli individui sono stati istruiti a non modificare le proprie abitudini e schemi alimentari, il livello di attività fisica o l'uso di contraccettivi orali durante lo studio, identificando così solo gli effetti dello Shiitake aggiunto alla dieta per ciascun individuo del gruppo esposto.

Interventi di studio. Lo studio è iniziato ufficialmente con 68 individui, che hanno firmato un termine di consenso informato. Nel primo (Tempo 0 - T0), nel secondo (Tempo 33 gg - T33) e nel terzo (Tempo 66 gg - T66) i soggetti sono stati sottoposti a valutazione nutrizionale e anamnesi, richiamo delle abitudini alimentari nelle 24 ore e frequenza alimentare.

Nel primo mese dello studio sono state prodotte 4.100 barrette di placebo o funghi e nel secondo mese la produzione è stata di 3.500 barrette. Secondo Grotto e collaboratori (2015), ha condotto uno studio valutando diverse concentrazioni di Shiitake (100, 400 e 800 mg/Kg/giorno) per determinare il grado di tossicità negli animali. La concentrazione di Shiitake di 100 mg/Kg/giorno si è dimostrata sicura. Inoltre, la formulazione della barretta dolce Shiitake è stata approvata nell'analisi sensoriale e nell'intenzione di acquisto nello studio precedente.

Randomizzazione Gli individui (68) sono stati assegnati in modo casuale (utilizzando una tabella di numeri casuali) in 2 gruppi: I - gruppo Placebo (n = 32) e II - gruppo di intervento (n = 36). Per garantire l'assunzione giornaliera raccomandata di Shiitake di 100 mg/Kg/giorno, ogni partecipante è stato ponderato per determinare il numero di barrette consumate al giorno.

Gli individui dopo la valutazione nutrizionale e la raccolta del sangue, hanno ricevuto una confezione opaca e sigillata non identificata contenente barre sottovuoto individuali per un periodo di T33 giorni. I pazienti e il raccoglitore di dati erano ciechi. Le barre dei gruppi di intervento e placebo erano simili per consistenza, sapore, aroma e aspetto.

Dopo un mese, tutti gli individui sono tornati all'Università di Sorocaba per nuove valutazioni nutrizionali, ricevendo più barrette alimentari e raccolta di sangue con la stessa cura in doppio cieco (T33). Al termine di sessantasei giorni (T66), i soggetti sono tornati per l'ultimo prelievo di sangue e la valutazione nutrizionale finale.

Analisi biochimiche Il colesterolo totale, il colesterolo LDL, il colesterolo HDL, i trigliceridi e il glucosio sono stati analizzati mediante kit commerciali, seguendo le specifiche del produttore, nell'apparecchiatura automatizzata COBAS C111 (Roche®) secondo le metodologie seguenti.

Per il colesterolo, 10 µL di campione e 1,0 mL di reagente enzimatico sono stati miscelati a 37 ºC per 10 minuti per la trasformazione totale in colesterolo libero, da parte dell'enzima lipoproteina lipasi. La reazione ha comportato l'ossidazione del colesterolo libero a colesterolo-3-one e H2O2 da parte dell'enzima colesterolo ossidasi. E con l'azione della perossidasi sul fenolo con 4-amminoantipirina formava un cromogeno color ciliegia, il cui colore era proporzionale alla concentrazione di colesterolo.

Per la determinazione delle HDL, il siero è stato trattato con acido fosfotungstato e cloruro di magnesio. Quindi, l'LDL è stato precipitato fuori dalla frazione dopo centrifugazione per 2 minuti a 10.000 rpm. L'HDL, rimasto nel surnatante, è stato eseguito secondo la metodologia del colesterolo. La concentrazione di HDL è proporzionale al colore. LDL è stato calcolato sottraendo il colesterolo HDL dal colesterolo totale.

I trigliceridi sierici sono stati idrolizzati a glicerolo e acidi grassi liberi dalla lipoproteina lipasi. In presenza di adenosina trifosfato (ATP) e glicerolo chinasi, il glicerolo-3-fosfato è stato fosforilato, che è stato ossidato ad acetone diidrogeno fosfato e H2O2 dalla glicerolo fosfato ossidasi. H2O2, 4-amminoantipirina e p-clorofenolo hanno subito lo stesso processo di reazione sopra riportato mediante perossidasi in bagnomaria a 37 ºC per 10 minuti fino alla formazione del colore rosso.

Per il test della glicemia, la glucosio-6-fosfato deidrogenasi ha ossidato il glucosio-6-fosfato in presenza di NADP in gluconato-6-fosfato. Nessun altro carboidrato è stato ossidato. La velocità di formazione di NADPH durante la reazione era direttamente proporzionale alla concentrazione di glucosio, essendo determinata fotometricamente.

Analisi dello Stress Ossidativo La determinazione del glutatione ridotto (GSH) è stata effettuata mediante quantificazione dei tioli totali ridotti. Per questo, 150 µL di sangue sono stati agitati con vortex con 100 µL 10% Triton X-100 e 100 µL 30% TCA, quindi centrifugati per 10 min a 4000 rpm. Nella cuvetta sono stati pipettati 900 µL di 1M TFK, 50 µL di surnatante e 50 µL di 10 mM DTNB, che hanno reagito formando un complesso giallo. La lettura è stata effettuata a 412 nm in uno spettrofotometro. Per il calcolo della concentrazione è stata utilizzata la curva di calibrazione con concentrazioni di GSH predefinite (0,005; 0,01; 0,025; 0,05; 0,1 mM).

Per valutare l'attività dell'enzima catalasi è stato utilizzato, basato sulla decomposizione di H2O2 da parte della catalasi, monitorata a 240 nm. Per questo, il sangue è stato diluito 60 volte in 50 mM TFK. Un'aliquota di 20 μL è stata miscelata a 1910 μL dello stesso TFK e sono stati aggiunti 70 μL di H2O2, avviando la reazione monitorata per tre minuti. Una costante di variazione (κ) al minuto ha aiutato nell'espressione dell'enzima catalasi (κ/min).

Le sostanze reattive all'acido tiobarbiturico (TBARS) sono state utilizzate come biomarcatori della perossidazione lipidica. Aliquote di plasma (150 µL) sono state miscelate con 50 µL di NaOH e 50 µL di acqua ultrapura Milli-Q (Direct 8, Millipore®) e incubate a 60 °C per 30 minuti con agitazione. 250 µL di 6% H₃PO₄, 250 µL di 0,8% TBA e 100 µL di 10% SDS sono stati aggiunti ai campioni e portati nel bagno a 80 °C per un'ora. I perossidi lipidici hanno reagito con TBA in mezzo acido per formare un composto rosa e letto in uno spettrofotometro a 532 nm. Per calcolare la concentrazione di TBARS nel plasma è stata realizzata una curva di calibrazione della malondialdeide, la principale sostanza reattiva all'acido tiobarbiturico (0,28; 0,56; 1,7; 3,4; 6,6 µM).