2 種類の骨髄炎の違いに関する研究

糖尿病性足骨髄炎（Dd 群）の被験者（標本数 10 例以上）および糖尿病を伴わない足の骨髄炎（ND 群）の被験者（標本数 10 例以上）を選択基準に従って収集した。 外科医は、骨髄炎の管理のために外科的介入（デブリードマンまたは切断）を必要とした 28 人の患者全員から術中の骨標本を収集しました [10]。 骨の病原体を予測する上で十分に正確ではなかったため、軟部組織または副鼻腔培養を避けました[11]。 滅菌生理食塩水で洗浄した感染組織または壊死組織の外科的デブリードマンに続いて、滅菌器具を使用して深部骨標本を採取しました。 定期的に適切な骨標本を入手し、それらを 3 つの部分に分けました。 1 つは定期的な微生物学培養および抗生物質感受性試験用、1 つは組織病理学用、もう 1 つは DNA 配列決定分析用です。 骨標本を取得するこのプロセスは、創傷組織に細菌を定着させることによる汚染の可能性を減らすことができます。

16S rRNA ハイスループット シーケンシング 2 つの標本が、従来の培養および組織病理学的検査のために研究室に送られました。 残った骨標本は、輸送培地なしで無菌パイプに入れ、4℃で24時間保存した後、DNA抽出まで-80℃で凍結しました。 製造元の指示に従って、DNA抽出キット（YiRui、深セン、中国）を使用してゲノムDNAを抽出しました。 抽出されたDNAは、アガロースゲル電気泳動（JS-power 300、PeiQin、上海、中国）による定量および品質管理でした。 次に、順方向および逆方向融合プライマー（341F：5'-CCTAYGGGRBGCASCAG-3'および806R：5'-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3）（ABI GeneAmp 9700 PCR楽器）。 PCR産物は、短い配列、シングルトン配列、およびノイズの多い読み取りを削除することにより増幅されました。 PCR 反応は、6 μl の 10 × Ex Tap PCR バッファー、6 μl の dNTP 混合物、0.6 μl のウシ血清アルブミン (BSA)、0.3 μl の Ex Tag、1 μl の DNA、1.2 μl を含む 60 μl の総量で実施しました。フォワードおよびリバース プライマー、および 43.7 μlH 2 O。 ＰＣＲ増幅は以下の条件下で行った：最初の変性は９４℃で５分間行い、続いて９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、および７２℃で４５秒間を２７サイクル行った。 最終伸長は、28 のサンプル (DFO および SFO 患者を含む) から 72°C で 10 分間実行され、Illumina Miseq で 2 回の別々のランでシーケンスされました。 高品質のクリーンな読み取りを得るために、生の読み取りは次のルールに従ってフィルタリングされました: (1) 10% を超える未知のヌクレオチドを含む読み取りを削除し、(2) 品質 (Q 値) > 20 の塩基の 80% 未満を含む読み取りを削除します。 フィルタリングされた読み取りは、10 bp を超えるオーバーラップと 2% 未満のミスマッチを持つペアエンド リード間のオーバーラップに従って、タグに組み立てられました。 ソフトウェア Mothur (v.1.34.0) を使用して冗長タグを削除し、一意のタグを取得しました。 次に、得られた一意のタグを使用して存在量を計算しました。次に、Greengene を使用して配列を操作上の分類単位 (OTU) にクラスター化しました。 属レベル（可能な場合は種レベル）で微生物を識別するために、97％の類似性で Greengene データベースに BLAST を使用して分類法を OTU に割り当てました。 系統樹は、figtree を使用して整列された代表的な OTU シーケンスから構築されました。ランドスケープ内の種の多様性の合計は、2 つの異なるパラメーターによって決定されました。よりローカルなスケールでのサイトまたは生息地の平均種多様性 (アルファ多様性) と、それらの生息地間の差異です。 (ベータ多様性)。 アルファ多様性には、コミュニティの多様性と豊かさの両方が含まれていました。コミュニティの豊かさは、ACE推定量またはChao1推定量によって表されました。 ベータ多様性は、種の進化に基づいて、マイクロバイオームのコミュニティ構造とメンバーシップの間の違い (距離) の計算でした。 この種の距離は、Weighted Unifrac を使用して計算され、主座標分析図で実行できます。

メタゲノム解析 試料からのメタゲノム DNA ライブラリーは、TruSeq Nano DNA キット (FC-121-4002) を使用して、製造元の指示に従って、若干の変更を加えて構築されました。 簡単に言えば、超音波処理によって長さが一致したDNA（350 bp）が得られました。 DNA 断片を末端修復し、適切なライブラリー サイズを選択した後、サンプルに A テールを付け、アダプターにライゲーションしました。 NovaSeq 6000 シーケンシング システム（イルミナ）は、シーケンシングとライブラリの検証に使用されました。品質 (Q 値)>20 の塩基の 80% 未満。 Megahit を使用して、品質管理後にシーケンス (クリーン データ) をスプライシングし、コンティグを取得しました。コンティグは 1000bp 以下でフィルター処理されました。 ベクターおよび宿主配列は、1e-5のE値カットオフでBLASTNによってフィルタリングされました。 残りのリードはSOAPアラインメントによってヒトゲノムにマッピングされ、一致するリードはホストゲノムからの汚染物質として削除されました.分類学的分類は、NCBIデータベースに対してBLASTを使用して、組み立てられたコンティグとシングルトンで実行されました. そして最高の BLAST ヒットは、各配列の分類学的ランクを参照するために使用されました。 すべての分析は R で実行され、p 値は、誤発見率法を使用した複数のテスト用に修正されました。