Studieren über den Unterschied zwischen zwei Arten von Osteomyelitis

Probanden mit diabetischer Fußosteomyelitis (Dd-Gruppe) (Stichprobengröße ≥ 10 Fälle) und Probanden mit Fußosteomyelitis ohne Diabetes (ND-Gruppe) (Stichprobengröße ≥ 10 Fälle) wurden gemäß den Einschlusskriterien erfasst. Chirurgen sammelten intraoperative Knochenproben von allen 28 Patienten, die einen chirurgischen Eingriff (Debridement oder Amputation) zur Behandlung ihrer Osteomyelitis benötigten[10]. Weichgewebe- oder Nebenhöhlenkulturen vermieden, da sie bei der Vorhersage von Knochenpathogenen nicht ausreichend genau waren[11]. Nach dem chirurgischen Debridement von infiziertem oder nekrotischem Gewebe, das mit steriler Kochsalzlösung gereinigt wurde, wurden tiefe Knochenproben mit sterilen Instrumenten entnommen. Wir haben routinemäßig adäquate Knochenproben entnommen und diese in drei Teile geteilt. Eines für routinemäßige mikrobiologische Kultur- und Antibiotika-Empfindlichkeitstests, eines für die Histopathologie und das andere für die DNA-Sequenzanalyse. Dieses Verfahren zur Gewinnung von Knochenproben könnte die Wahrscheinlichkeit einer Kontamination durch Bakterien verringern, die Wundgewebe besiedeln.

16S-rRNA-Hochdurchsatzsequenzierung Zwei Proben wurden zur konventionellen Kultivierung und histopathologischen Untersuchung an das Labor geschickt. Die verbleibenden Knochenproben wurden ohne Transportmedium in sterile Rohre gegeben und 24 Stunden bei 4 ° C gelagert und dann bis zur DNA-Extraktion bei -80 ° C eingefroren. Genomische DNA wurde unter Verwendung des DNA-Extraktionskits (YiRui, ShenZhen, China) gemäß den Anweisungen des Herstellers extrahiert. Die extrahierte DNA wurde quantitativ und der Qualitätskontrolle durch Agarose-Gelelektrophorese (JS-Power 300, PeiQin, Shanghai, China) unterzogen. Dann amplifizierten wir die variable Region V3-V4 des 16S-rRNA-Gens für die Sequenzierung unter Verwendung eines Vorwärts- und eines Rückwärts-Fusionsprimers (341F: 5'-CCTAYGGGRBGCASCAG-3' und 806R: 5'-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3) (ABI GeneAmp 9700 PCR Instrument). PCR-Produkte wurden amplifiziert, indem kurze Sequenzen, Singleton-Sequenzen und verrauschte Lesevorgänge entfernt wurden. Die PCR-Reaktion wurde in einem Gesamtvolumen von 60 μl durchgeführt, das 6 μl 10 × Ex Tap PCR-Puffer, 6 μl dNTP-Gemisch, 0,6 μl Rinderserumalbumin (BSA), 0,3 μl Ex-Tag, 1 μl DNA, 1,2 μl enthielt Forward- und Reverse-Primer und 43,7 μl H 2 O. Die PCR-Amplifikation wurde unter den folgenden Bedingungen durchgeführt: Die anfängliche Denaturierung wurde bei 94°C für 5 min durchgeführt, gefolgt von 27 Zyklen bei 94°C für 30 s, 55°C für 30 s und 72°C für 45 s. Eine abschließende Verlängerung wurde bei 72 °C für 10 Minuten aus 28 Proben (einschließlich DFO- und SFO-Patienten) durchgeführt, die in zwei separaten Läufen auf Illumina Miseq sequenziert wurden. Um saubere Reads von hoher Qualität zu erhalten, wurden Raw-Reads gemäß den folgenden Regeln gefiltert: (1) Reads entfernen, die mehr als 10 % unbekannte Nukleotide enthalten, und (2) Reads entfernen, die weniger als 80 % Basen mit Qualität (Q-Wert) > 20 enthalten. Die gefilterten Reads wurden dann gemäß der Überlappung zwischen Paired-End-Reads mit mehr als 10 bp Überlappung und weniger als 2 % Fehlanpassung zu Tags zusammengesetzt. Die Software Mothur (v.1.34.0) wurde verwendet, um die redundanten Tags zu entfernen, um eindeutige Tags zu erhalten. Die erhaltenen eindeutigen Tags wurden dann verwendet, um die Häufigkeit zu berechnen. Dann gruppierten wir Sequenzen unter Verwendung von Greengene in operationelle taxonomische Einheiten (OTUs). Die Taxonomie wurde OTUs unter Verwendung der BLASTto the Greengene-Datenbank bei 97 % Ähnlichkeit zugewiesen, um Mikroorganismen auf Gattungsebene (Artenebene, wo möglich) zu identifizieren. Ein phylogenetischer Baum wurde aus ausgerichteten repräsentativen OTU-Sequenzen unter Verwendung von Feigenbäumen erstellt. Die gesamte Artenvielfalt in einer Landschaft wurde durch zwei verschiedene Parameter bestimmt, die mittlere Artenvielfalt an Standorten oder Lebensräumen auf einer eher lokalen Ebene (Alpha-Diversität) und die Differenzierung zwischen diesen Lebensräumen (Beta-Vielfalt). Die Alpha-Diversität umfasste sowohl die Diversität als auch den Reichtum der Gemeinschaft: Der Reichtum der Gemeinschaft wurde durch den ACE-Schätzer oder den Chao1-Schätzer dargestellt. Beta-Diversität war die Berechnung von Unterschieden (Abstand) zwischen der Mikrobiom-Gemeinschaftsstruktur und der Mitgliedschaft basierend auf der Evolution der Arten. Diese Art von Distanz wurde mit Weighted Unifrac berechnet und kann mit dem Hauptkoordinatenanalyse-Diagramm dargestellt werden.

Metagenomanalyse Eine Metagenom-DNA-Bibliothek aus Proben wurde mit dem TruSeq Nano DNA-Kit (FC-121-4002) gemäß den Anweisungen des Herstellers mit geringfügigen Modifikationen erstellt. Kurz gesagt wurde die DNA mit angepasster Länge (350 bp) durch Beschallung erhalten. DNA-Fragmente wurden am Ende repariert und die geeignete Bibliotheksgröße wurde ausgewählt, dann wurden die Proben mit einem A-Schwanz versehen und an Adapter ligiert. Die NovaSeq 6000-Sequenziersysteme (Illumina) wurden für die Sequenzierung und Bibliotheksvalidierung verwendet. Rohdaten, die durch Sequenzierung erhalten wurden, weisen gemäß den folgenden Regeln einen bestimmten Anteil an Daten niedriger Qualität auf: (1) Entfernen Sie Reads, die mehr als 10 % unbekannte Nukleotide enthalten, und (2) Entfernen Sie Reads, die enthalten weniger als 80 % der Basen mit Qualität (Q-Wert) >20 . Megahit wurde verwendet, um die Sequenzen (saubere Daten) nach der Qualitätskontrolle zu spleißen, und Contigs wurden erhalten. Contigs wurden unter 1000 bp gefiltert. Die Vektor- und Wirtssequenzen wurden durch BLASTN mit einem E-Wert-Cutoff von 1e-5 gefiltert. Die verbleibenden Reads wurden durch SOAP-Alignment auf das menschliche Genom abgebildet, und die passenden Reads wurden als Verunreinigungen aus dem Wirtsgenom entfernt. Die taxonomischen Klassifizierungen wurden an zusammengesetzten Contigs und Singletons unter Verwendung von BLAST gegen die NCBI-Datenbank durchgeführt. Und der beste BLAST-Treffer wurde verwendet, um auf den taxonomischen Rang jeder Sequenz zu verweisen. Alle Analysen wurden in R durchgeführt und die p-Werte wurden für mehrfaches Testen mit der Methode der falschen Entdeckungsrate korrigiert.