Az osteomyelitis két fajtája közötti különbség tanulmányozása

A diabéteszes láb osteomyelitisben (Dd csoport) szenvedő alanyokat (mintanagyság ≥ 10 eset) és lábfej osteomyelitisben szenvedő alanyokat cukorbetegség nélkül (ND csoport) (mintanagyság ≥ 10 eset) gyűjtöttük a felvételi kritériumoknak megfelelően. A sebészek intraoperatív csontmintákat gyűjtöttek mind a 28 betegtől, akiknél sebészeti beavatkozásra (debridement vagy amputáció) volt szükség az osteomyelitis kezelésére[10]. Kerülték a lágyrész- vagy sinustraktus-tenyészeteket, mert nem voltak kellően pontosak a csontkórokozók előrejelzésében[11]. A fertőzött vagy nekrotikus szövet sebészeti eltávolítását követően, steril sóoldattal megtisztítottuk, mély csontmintákat vettünk steril eszközökkel. Rutinszerűen vettünk megfelelő csontmintákat, és három részre osztottuk őket. Az egyik a rutin mikrobiológiai tenyésztéshez és az antibiotikum érzékenység vizsgálatához, az egyik a kórszövettani, a másik a DNS-szekvenálás elemzéséhez. Ez a csontminták beszerzési eljárása csökkentheti a sebszövetben kolonizáló baktériumok általi szennyeződés esélyét.

16S rRNS nagy áteresztőképességű szekvenálás Két mintát küldtünk a laboratóriumba hagyományos tenyésztésre és kórszövettani vizsgálatokra. A megmaradt csontmintát steril csövekbe helyeztük szállítóközeg nélkül, és 4 °C-on tároltuk 24 órán át, majd -80 °C-on lefagyasztottuk a DNS-kivonásig. A genomi DNS-t DNS extrakciós készlettel (YiRui, Shenzhen, Kína) extraháltuk a gyártó utasításai szerint. A kivont DNS mennyiségi és minőségi ellenőrzése agaróz gélelektroforézissel történt (JS-power 300, PeiQin, ShangHai, Kína). Ezután a 16S rRNS gén V3-V4 variábilis régióját amplifikáltuk a szekvenáláshoz egy előre és egy fordított fúziós primerrel (341F：5'-CCTAYGGGRBGCASCAG-3' és 806R：5'-GGACTACNGGGTATCTAAT(9BI00Amp) gén. Hangszer). A PCR-termékeket a rövid szekvenciák, az egytagú szekvenciák és a zajos leolvasások eltávolításával amplifikáltuk. A PCR-reakciót 60 μl össztérfogatban hajtották végre, amely 6 μl 10× Ex Tap PCR puffert, 6 μl dNTP keveréket, 0,6 μl szarvasmarha szérum albumint (BSA), 0,3 μl Ex Tagot, 1 μl DNS-t, 1,2 μl tartalmazott. előre és fordított primerek, valamint 43,7 μlH 2O. A PCR-amplifikációt a következő körülmények között hajtottuk végre: a kezdeti denaturálást 94 °C-on 5 percig végeztük, amit 27 ciklus követett 94 °C-on 30 másodpercig, 55 °C-on 30 másodpercig és 72 °C-on 45 másodpercig. Az utolsó meghosszabbítást 72 °C-on 10 percig végezték el 28 mintából (beleértve a DFO-s és SFO-s betegeket is), amelyeket két külön futtatás során szekvenáltak Illumina Miseq-en. A kiváló minőségű tiszta leolvasások érdekében a nyers leolvasásokat a következő szabályok szerint szűrtük: (1) távolítsa el a több mint 10% ismeretlen nukleotidot tartalmazó leolvasásokat és (2) távolítsa el a kevesebb mint 80% bázist tartalmazó leolvasásokat, amelyek minősége (Q-érték)>20. A szűrt leolvasásokat ezután címkékké gyűjtöttük össze a 10 bp-nál nagyobb átfedéssel és 2%-nál kisebb eltéréssel rendelkező páros végű leolvasások közötti átfedés szerint. A Mothur (v.1.34.0) szoftverrel távolították el a redundáns címkéket, hogy egyedi címkéket kapjanak. A kapott egyedi címkéket ezután felhasználtuk a bőség kiszámításához. Ezután a szekvenciákat operatív taxonómiai egységekre (OTU-k) csoportosítottuk a Greengene segítségével. A taxonómiát az OTU-khoz rendelték hozzá a BLASTto a Greengene adatbázishoz 97%-os hasonlósággal, hogy azonosítsák a mikroorganizmusokat nemzetség szinten (ahol lehetséges, faj szinten). Egy filogenetikai fát építettek egymáshoz illesztett reprezentatív OTU szekvenciákból fügefa felhasználásával. A teljes fajdiverzitást egy tájban két különböző paraméter határozta meg, a helyek vagy élőhelyek átlagos fajdiverzitása lokálisabb léptékben (alfa diverzitás) és az élőhelyek közötti különbségtétel. (béta változatosság). Az alfa-diverzitás magában foglalta a közösségi diverzitást és a gazdagságot is: a közösség gazdagságát az ACE becslés vagy a Chao1 becslés jelentette. A béta diverzitás a mikrobióm közösség szerkezete és a tagság közötti különbségek (távolság) kiszámítása volt a fajok evolúciója alapján. Ezt a fajta távolságot a Súlyozott Unifrac segítségével számították ki, és a főkoordináta-elemzés diagramjával lehet végrehajtani.

Metagenóm-elemzés A mintákból származó metagenom DNS-könyvtárakat TruSeq Nano DNS kit (FC-121-4002) segítségével állítottuk elő a gyártó utasításai szerint, kis módosításokkal. Röviden, a hosszúságú DNS-t (350 bp) ultrahanggal kaptuk. A DNS-fragmensek végét javítottuk, és kiválasztottuk a megfelelő könyvtárméretet, majd a mintákat A-farokkal kötöttük és adapterekhez ligáltuk. A NovaSeq 6000 szekvenáló rendszereket (Illumina) a szekvenáláshoz és a könyvtár érvényesítéséhez használták. A szekvenálással nyert nyers adatok bizonyos hányada rossz minőségű adatokkal rendelkezik a következő szabályok szerint: (1) távolítsa el a több mint 10%-ban ismeretlen nukleotidot tartalmazó leolvasásokat, és (2) távolítsa el a a bázisok kevesebb, mint 80%-a minőséggel (Q-érték)>20 . Megahit használtuk a szekvenciák összeillesztésére (tiszta adatok) a minőség-ellenőrzés után, és kontigokat kaptunk. A kontigokat 1000 bp alatt szűrtük. A vektor- és gazdaszekvenciákat BLASTN-nel szűrtük, 1e-5 E-érték határértékkel. A fennmaradó leolvasásokat SOAP-illesztéssel térképeztük fel a humán genomra, és az egyező leolvasásokat eltávolítottuk, mint szennyeződéseket a gazda genomjából. A taxonómiai osztályozást összeállított kontigokon és szinglitonokon végeztük el a BLAST segítségével az NCBI adatbázissal összehasonlítva. És a legjobb BLAST találatot használták az egyes szekvenciák taxonómiai rangjának hivatkozására. Az összes elemzést R-ben végezték el, és a p értékeket többszörös tesztelésre korrigáltuk a hamis felfedezési arány módszerével.