Studio sulla differenza tra due tipi di osteomielite

I soggetti con osteomielite del piede diabetico (gruppo Dd) (dimensione del campione ≥ 10 casi) e i soggetti con osteomielite del piede senza diabete (gruppo ND) (dimensione del campione ≥ 10 casi) sono stati raccolti secondo i criteri di inclusione. I chirurghi hanno raccolto campioni ossei intraoperatori da tutti i 28 pazienti che hanno richiesto un intervento chirurgico (sbrigliamento o amputazione) per la gestione della loro osteomielite[10]. Sono state evitate le colture dei tessuti molli o del tratto sinusale, perché non erano sufficientemente accurate nel predire i patogeni ossei[11]. Dopo lo sbrigliamento chirurgico del tessuto infetto o necrotico, pulito con soluzione salina sterile, sono stati prelevati campioni ossei profondi utilizzando strumenti sterili. Abbiamo regolarmente ottenuto campioni ossei adeguati e li abbiamo divisi in tre parti. Uno per la coltura microbiologica di routine e il test di sensibilità agli antibiotici, uno per l'istopatologia e l'altro per l'analisi del sequenziamento del DNA. Questo processo per ottenere campioni ossei potrebbe ridurre le possibilità di contaminazione da parte dei batteri che colonizzano il tessuto della ferita.

16S rRNA high-throughput sequencing Due campioni sono stati inviati al laboratorio per la coltura convenzionale ei test istopatologici. I campioni ossei rimasti sono stati posti in tubi sterili senza alcun mezzo di trasporto e conservati a 4℃ per 24 ore e poi congelati a -80C fino all'estrazione del DNA. Il DNA genomico è stato estratto utilizzando il kit di estrazione del DNA (YiRui, ShenZhen, Cina) secondo le istruzioni del produttore. Il DNA estratto è stato controllato quantitativamente e di qualità mediante elettroforesi su gel di agarosio (JS-power 300, PeiQin, ShangHai, Cina). Quindi abbiamo amplificato la regione variabile V3-V4 del gene rRNA 16S per il sequenziamento utilizzando un primer di fusione diretta e inversa-（341F：5'-CCTAYGGGRBGCASCAG-3' e 806R：5'-GGACTACNNGGGGTATCTAAT-3）(ABI GeneAmp 9700 PCR Strumento). I prodotti PCR sono stati amplificati rimuovendo sequenze brevi, sequenze singleton e letture rumorose. La reazione PCR è stata eseguita in un volume totale di 60 μl, contenente 6 μl di tampone PCR 10× Ex Tap, 6 μl di miscela dNTP, 0,6 μl di albumina di siero bovino (BSA), 0,3 μl Ex Tag, 1 μl di DNA, 1,2 μl primer forward e reverse e 43,7 μlH 2O. L'amplificazione PCR è stata condotta nelle seguenti condizioni: la denaturazione iniziale è stata condotta a 94°C per 5 minuti, seguita da 27 cicli a 94°C per 30s, 55°C per 30s e 72°C per 45s. Un'estensione finale è stata eseguita a 72°C per 10 minuti da 28 campioni (inclusi pazienti DFO e SFO) che sono stati sequenziati in due corse separate su Illumina Miseq. Per ottenere letture pulite di alta qualità, le letture grezze sono state filtrate in base alle seguenti regole: (1) rimuovere letture contenenti più del 10% di nucleotidi sconosciuti e (2) rimuovere letture contenenti meno dell'80% di basi con qualità (valore Q)> 20. Le letture filtrate sono state quindi assemblate in tag in base alla sovrapposizione tra letture paired-end con sovrapposizione superiore a 10 bp e disallineamento inferiore al 2%. Il software Mothur (v.1.34.0) è stato utilizzato per rimuovere i tag ridondanti per ottenere tag univoci. I tag univoci ottenuti sono stati quindi utilizzati per calcolare l'abbondanza. Quindi abbiamo raggruppato le sequenze in unità tassonomiche operative (OTU) utilizzando Greengene. La tassonomia è stata assegnata alle OTU utilizzando il BLAST al database Greengene con una somiglianza del 97% per identificare i microrganismi a livello di generi (livello di specie ove possibile). Un albero filogenetico è stato costruito da sequenze OTU rappresentative allineate utilizzando il fico. La diversità totale delle specie in un paesaggio è stata determinata da due diversi parametri, la diversità media delle specie in siti o habitat su scala più locale (diversità alfa) e la differenziazione tra quegli habitat (diversità beta). La diversità alfa includeva sia la diversità della comunità che la ricchezza: la ricchezza della comunità era rappresentata dallo stimatore ACE o dallo stimatore Chao1. La diversità beta era il calcolo delle differenze (distanza) tra la struttura della comunità del microbioma e l'appartenenza in base all'evoluzione delle specie. Questo tipo di distanza è stata calcolata utilizzando Weighted Unifrac e può essere eseguita dal diagramma di analisi delle coordinate principali.

Analisi del metagenoma Una libreria di metagenoma di DNA da campioni è stata costruita utilizzando il kit TruSeq Nano DNA (FC-121-4002) secondo le istruzioni del produttore, con lievi modifiche. In breve, il DNA conforme alla lunghezza (350 bp) è stato ottenuto mediante sonicazione. I frammenti di DNA sono stati riparati all'estremità ed è stata selezionata la dimensione della libreria appropriata, quindi i campioni sono stati dotati di coda A e legati agli adattatori. I sistemi di sequenziamento NovaSeq 6000 (Illumina) sono stati utilizzati per il sequenziamento e la convalida della libreria I dati grezzi ottenuti dal sequenziamento hanno una certa proporzione di dati di bassa qualità in base alle seguenti regole: (1) rimuovere le letture contenenti più del 10% di nucleotidi sconosciuti e (2) rimuovere le letture contenenti meno dell'80% di basi con qualità (valore Q)>20. Megahit è stato utilizzato per unire le sequenze (dati puliti) dopo il controllo di qualità e sono stati ottenuti i contig. I contig sono stati filtrati al di sotto di 1000 bp. Le sequenze del vettore e dell'ospite sono state filtrate da BLASTN, con un limite di valore E di 1e-5. Le letture rimanenti sono state mappate al genoma umano mediante allineamento SOAP e le letture corrispondenti sono state rimosse in quanto contaminanti dal genoma dell'ospite. Le classificazioni tassonomiche sono state eseguite su contig e singleton assemblati utilizzando BLAST rispetto al database NCBI. E il miglior successo BLAST è stato utilizzato per fare riferimento al rango tassonomico di ciascuna sequenza. Tutte le analisi sono state eseguite in valori R e p sono stati corretti per test multipli con il metodo del tasso di scoperta falsa.