Kahden osteomyeliitin välisen eron tutkiminen

Diabeettista jalkaosteomyeliittiä (Dd-ryhmä) sairastavat (näytteen koko ≥ 10 tapausta) ja jalkojen osteomyeliittiä ilman diabetesta (ND-ryhmä) koehenkilöt (näytteen koko ≥ 10 tapausta) kerättiin mukaanottokriteerien mukaisesti. Kirurgit keräsivät leikkauksen aikana luunäytteitä kaikilta 28 potilaalta, jotka tarvitsivat kirurgista toimenpidettä (poisto tai amputaatio) osteomyeliitin hoitamiseksi[10]. Vältä pehmytkudos- tai poskionteloiden viljelmiä, koska ne eivät olleet riittävän tarkkoja luupatogeenien ennustamisessa[11]. Steriilillä suolaliuoksella puhdistetun infektoituneen tai nekroottisen kudoksen kirurgisen puhdistamisen jälkeen otettiin syvät luunäytteet steriileillä instrumenteilla. Otimme rutiininomaisesti riittävät luunäytteet ja jaoimme ne kolmeen osaan. Toinen rutiininomaiseen mikrobiologiseen viljelyyn ja antibioottiherkkyystestaukseen, toinen histopatologiaan ja toinen DNA-sekvensointianalyysiin. Tämä luunäytteiden hankkimisprosessi voi vähentää haavakudosta kolonisoivien bakteerien aiheuttamaa kontaminaatiota.

16S rRNA:n korkean suorituskyvyn sekvensointi Kaksi näytettä lähetettiin laboratorioon tavanomaista viljelyä ja histopatologisia testejä varten. Jäljelle jäänyt luunäyte laitettiin steriileihin putkiin ilman kuljetusväliainetta ja säilytettiin 4 ℃:ssa 24 tuntia ja jäädytettiin sitten -80 C:ssa DNA-uuttoon asti. Genominen DNA uutettiin käyttämällä DNA:n uuttosarjaa (YiRui, Shenzhen, Kiina) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Uutettu DNA oli kvantitatiivinen ja laadunvalvonta agaroosigeelielektroforeesilla (JS-power 300, PeiQin, ShangHai, Kiina). Sitten monistimme 16S-rRNA-geenin V3-V4-variaabelin alueen sekvensointia varten käyttämällä eteenpäin- ja käänteisfuusioaluketta (341F：5'-CCTAYGGGRBGCASCAG-3' ja 806R：5'-GGACTACNGGGTATCTAAT(9BI00Amp) Instrumentti). PCR-tuotteet monistettiin poistamalla lyhyet sekvenssit, yksittäiset sekvenssit ja kohinaiset lukemat. PCR-reaktio suoritettiin 60 μl:n kokonaistilavuudessa, joka sisälsi 6 μl 10× Ex Tap PCR-puskuria, 6 μl dNTP-seosta, 0,6 μl naudan seerumialbumiinia (BSA), 0,3 μl Ex Tag, 1 μl DNA:ta, 1,2 μl eteenpäin ja taaksepäin alukkeet ja 43,7 μlH 2O. PCR-monistus suoritettiin seuraavissa olosuhteissa: alkuperäinen denaturointi suoritettiin 94 °C:ssa 5 minuutin ajan, jota seurasi 27 sykliä 94 °C:ssa 30 sekuntia, 55 °C:ssa 30 sekuntia ja 72 °C:ssa 45 sekuntia. Viimeinen pidennys suoritettiin 72 °C:ssa 10 minuutin ajan, kun 28 näytettä (mukaan lukien DFO- ja SFO-potilaat) sekvensoitiin kahdella erillisellä ajolla Illumina Miseqillä. Korkealaatuisten puhtaiden lukemien saamiseksi raakalukemat suodatettiin seuraavien sääntöjen mukaisesti: (1) poista lukemat, jotka sisälsivät yli 10 % tuntemattomia nukleotideja ja (2) poista lukemat, jotka sisältävät alle 80 % emäksiä, joiden laatu (Q-arvo) >20. Suodatetut lukemat koottiin sitten tunnisteiksi yli 10 bp:n päällekkäisyyksien ja alle 2 %:n yhteensopimattomuuden parillisten lukujen päällekkäisyyden mukaan. Mothur-ohjelmistoa (v.1.34.0) käytettiin poistamaan ylimääräiset tunnisteet yksilöllisten tunnisteiden saamiseksi. Saatuja ainutlaatuisia tunnisteita käytettiin sitten runsauden laskemiseen. Sitten ryhmittelimme sekvenssit operatiivisiin taksonomisiin yksiköihin (OTU) Greengenen avulla. Taksonomia annettiin OTU:ille käyttämällä BLAST-ohjelmaa Greengene-tietokantaan 97 %:n samankaltaisella tavalla mikro-organismien tunnistamiseksi sukutasolla (lajitasolla, jos mahdollista). Fylogeneettinen puu rakennettiin kohdistetuista edustavista OTU-sekvensseistä viikunapuun avulla. Maiseman lajien kokonaisdiversiteetti määritettiin kahdella eri parametrilla, keskimääräisellä lajien monimuotoisuudella paikoissa tai elinympäristöissä paikallisemmassa mittakaavassa (alfa-diversiteetti) ja näiden elinympäristöjen välisellä erottelulla. (beta-monimuotoisuus). Alfa-diversiteetti sisälsi sekä yhteisön monimuotoisuuden että rikkauden: yhteisön rikkautta edusti ACE-estimaattori tai Chao1-estimaattori. Beta-diversiteetti oli mikrobiomiyhteisörakenteen ja -jäsenyyden välisten erojen (etäisyyden) laskeminen lajien evoluutioon perustuen. Tällainen etäisyys laskettiin painotetulla Unifracilla, ja se voidaan suorittaa pääkoordinaattianalyysikaaviolla.

Metagenomien analyysi Näytteistä muodostettiin metagenomi-DNA-kirjastot käyttämällä TruSeq Nano DNA -kittiä (FC-121-4002) valmistajan ohjeiden mukaisesti, pienin muutoksin. Lyhyesti sanottuna pituuden mukainen DNA (350 bp) saatiin sonikaatiolla. DNA-fragmenttien päät korjattiin ja sopiva kirjaston koko valittiin, sitten näytteet sidottiin A-pyrstöihin ja ligoitiin sovittimiin. NovaSeq 6000 -sekvensointijärjestelmiä (Illumina) käytettiin sekvensointiin ja kirjaston validointiin. Sekvensoinnilla saaduissa raakatiedoissa on tietty osa heikkolaatuista dataa seuraavien sääntöjen mukaisesti: (1) poista luennot, jotka sisältävät yli 10 % tuntemattomia nukleotideja ja (2) poista lukemat, jotka sisältävät alle 80 % emäksistä, joiden laatu (Q-arvo) >20 . Megahitia käytettiin sekvenssien silmukointiin (puhtaat tiedot) laadunvalvonnan jälkeen, ja jatkot saatiin. Jatkut suodatettiin alle 1000 bp:n. Vektori- ja isäntäsekvenssit suodatettiin BLASTN:llä E-arvon rajalla 1e-5. Loput lukemat kartoitettiin ihmisen genomiin SOAP-kohdistuksen avulla, ja vastaavat lukemat poistettiin kontaminantteina isäntägenomista. Taksonominen luokittelu suoritettiin kootuille jatkumoille ja singletoneille käyttämällä BLAST-menetelmää NCBI-tietokantaa vastaan. Ja parasta BLAST-osumaa käytettiin viittaamaan kunkin sekvenssin taksonomiseen järjestykseen. Kaikki analyysit on suoritettu R:llä ja p-arvot on korjattu moninkertaista testausta varten väärän havaitsemisnopeuden menetelmällä.