Studerer på forskjellen mellom to typer osteomyelitt

Pasienter med diabetes fot osteomyelitt (Dd-gruppe) (prøvestørrelse ≥ 10 tilfeller) og fotosteomyelitt uten diabetes (ND-gruppe) (prøvestørrelse ≥ 10 tilfeller) ble samlet inn i henhold til inklusjonskriteriene. Kirurger samlet inn intraoperative beinprøver fra alle 28 pasienter som trengte kirurgisk inngrep (debridement eller amputasjon) for å håndtere deres osteomyelitt[10]. Unngikk bløtvevs- eller sinuskulturer, fordi de ikke var tilstrekkelig nøyaktige til å forutsi benpatogener[11]. Etter kirurgisk debridering av infisert eller nekrotisk vev, renset med steril saltvannsløsning, ble dype benprøver høstet ved bruk av sterile instrumenter. Vi skaffet rutinemessig tilstrekkelige beinprøver og delte dem inn i tre deler. En for rutinemessig mikrobiologisk kultur og antibiotikasensitivitetstesting, en for histopatologi, og den andre for DNA-sekvensanalyse. Denne prosessen for å få beinprøver kan redusere sjansene for kontaminering av sårvevskoloniserende bakterier.

16S rRNA high-throughput sekvensering To prøver ble sendt til laboratoriet for konvensjonell dyrking og histopatologiske tester. Benprøven som var igjen ble plassert i sterile rør uten transportmedium og lagret ved 4 ℃ i 24 timer og deretter frosset ved -80 C inntil DNA-ekstraksjon. Genomisk DNA ble ekstrahert ved bruk av DNA-ekstraksjonssett (YiRui, ShenZhen, Kina) i henhold til produsentens instruksjoner. Ekstrahert DNA var kvantitativ og kvalitetskontroll ved agarosegelelektroforese (JS-power 300, PeiQin, Shanghai, Kina). Deretter amplifiserte vi den variable V3-V4-regionen til 16S rRNA-genet for sekvensering ved å bruke en forover og en revers fusjonsprimer-(341F：5'-CCTAYGGGRBGCASCAG-3' og 806R：5'-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3)(ABI Gene PCR) Instrument). PCR-produkter ble amplifisert ved å fjerne korte sekvenser, singleton-sekvenser og støyende avlesninger. PCR-reaksjonen ble utført i et totalt volum på 60 μl, inneholdende 6 μl 10× Ex Tap PCR-buffer, 6 μl dNTP-blanding, 0,6 μl bovint serumalbumin (BSA), 0,3 μl Ex Tag, 1μl DNA, 1,2 μl forover og bakover primere, og 43,7 μlH 2O. PCR-amplifiseringen ble utført under følgende betingelser: initial denaturering ble utført ved 94°C i 5 minutter, som ble fulgt av 27 sykluser ved 94°C i 30 sekunder, 55°C i 30 sekunder og 72°C i 45 sekunder. En siste forlengelse ble utført ved 72 °C i 10 minutter fra 28 prøver (inkludert DFO- og SFO-pasienter) ble sekvensert over to separate kjøringer på Illumina Miseq. For å få rene avlesninger av høy kvalitet, ble råavlesninger filtrert i henhold til følgende regler: (1) fjern avlesninger som inneholder mer enn 10 % av ukjente nukleotider og (2) fjern avlesninger som inneholder mindre enn 80 % av baser med kvalitet (Q-verdi)>20. De filtrerte avlesningene ble deretter satt sammen til tagger i henhold til overlapping mellom avlesninger med parede ende med mer enn 10 bp overlapping, og mindre enn 2 % mismatch. Programvaren Mothur (v.1.34.0) ble brukt til å fjerne de overflødige taggene for å få unike tagger. De oppnådde unike taggene ble deretter brukt til å beregne overfloden. Deretter grupperte vi sekvenser i operasjonelle taksonomiske enheter (OTUs) ved å bruke Greengene. Taksonomi ble tildelt OTUer ved å bruke BLASTto Greengene-databasen med 97% likhet for å identifisere mikroorganismer på slektsnivå (artsnivå der det er mulig). Et fylogenetisk tre ble bygget fra justerte representative OTU-sekvenser ved bruk av figtree. Det totale artsmangfoldet i et landskap ble bestemt av to forskjellige parametere, gjennomsnittlig artsdiversitet i lokaliteter eller habitater i en mer lokal skala (alfa-diversitet) og differensieringen mellom disse habitatene (beta-mangfold). Alfa-mangfold inkluderte både fellesskapsmangfold og rikdom: fellesskapsrikdom ble representert av ACE-estimatoren eller Chao1-estimatoren. Beta-diversitet var beregningen av forskjeller (avstand) mellom mikrobiomsamfunnets struktur og medlemskap basert på utviklingen av arter. Denne typen avstand ble beregnet ved hjelp av Weighted Unifrac og kan utføres av Principal Co-ordinates Analysis-diagram.

Metagenomanalyse Et metagenom-DNA-bibliotek fra prøver ble konstruert ved bruk av TruSeq Nano DNA-sett (FC-121-4002) i henhold til produsentens instruksjoner, med små modifikasjoner. Kort fortalt ble lengden tilpasset DNA (350 bp) oppnådd ved sonikering. DNA-fragmenter ble ende-reparert og passende bibliotekstørrelse ble valgt, deretter ble prøvene A-hale og ligert til adaptere. NovaSeq 6000-sekvenseringssystemene (Illumina) ble brukt til sekvensering og bibliotekvalidering. Rådata innhentet ved sekvensering har en viss andel lavkvalitetsdata i henhold til følgende regler: (1) fjern lesninger som inneholder mer enn 10 % ukjente nukleotider og (2) fjernlesninger mindre enn 80 % av baser med kvalitet (Q-verdi)>20 . Megahit ble brukt til å spleise sekvensene (rene data) etter kvalitetskontroll, og contigs ble oppnådd. Contigs ble filtrert under 1000bp. Vektor- og vertssekvensene ble filtrert med BLASTN, med en E-verdi cutoff på 1e-5. De resterende avlesningene ble kartlagt til det menneskelige genomet ved SOAP-justering, og de samsvarende avlesningene ble fjernet som forurensninger fra vertsgenomet. De taksonomiske klassifiseringene ble utført på sammensatte contigs og singletons ved bruk av BLAST mot NCBI-databasen. Og det beste BLAST-treffet ble brukt til å referere den taksonomiske rangeringen til hver sekvens. Alle analysene er utført i R og p-verdier ble korrigert for flere tester med metoden for falsk oppdagelse.