两种骨髓炎的区别研究

按照纳入标准收集糖尿病足骨髓炎（Dd组）受试者（样本量≥10例）和非糖尿病足骨髓炎（ND组）受试者（样本量≥10例）。 外科医生收集了所有 28 名需要手术干预（清创术或截肢术）以治疗骨髓炎的患者的术中骨标本[10]。 避免软组织或窦道培养，因为它们在预测骨病原体方面不够准确[11]。 在对感染或坏死组织进行手术清创后，用无菌生理盐水清洗，使用无菌器械采集深部骨标本。 我们通常会获取足够的骨骼标本并将它们分成三部分。 一种用于常规微生物培养和抗生素敏感性测试，一种用于组织病理学，另一种用于 DNA 测序分析。 这种获取骨骼标本的过程可以减少伤口组织定植细菌污染的机会。

16S rRNA高通量测序 两份标本送实验室进行常规培养和组织病理学检测。 将剩下的骨标本置于无任何运输介质的无菌管中，4℃保存24小时，-80℃冷冻直至DNA提取。 根据制造商的说明，使用DNA提取试剂盒（YiRui，ShenZhen，China）提取基因组DNA。 通过琼脂糖凝胶电泳（JS-power 300，PeiQin，上海，中国）对提取的 DNA 进行定量和质量控制。 然后使用正向和反向融合引物-（341F：5'-CCTAYGGGRBGCASCAG-3'和806R：5'-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3）扩增16S rRNA基因的V3-V4可变区进行测序（ABI GeneAmp 9700 PCR乐器）。 通过去除短序列、单一序列和噪声读数来扩增 PCR 产物。 PCR反应总体积为60μl，含有6μl 10×Ex Tap PCR buffer，6μl dNTP混合液，0.6μl牛血清白蛋白（BSA），0.3μl Ex Tag，1μl DNA，1.2μl正向和反向引物，以及 43.7 μlH 2O。 PCR扩增在以下条件下进行：初始变性在94℃进行5分钟，然后在94℃进行30秒、55℃进行30秒和72℃进行27个循环45秒。 最后一次延伸在 72°C 下进行 10 分钟，来自 28 个样本（包括 DFO 和 SFO 患者），这些样本在 Illumina Miseq 上进行了两次单独的测序。 为了获得高质量的 clean reads，原始 reads 根据以下规则进行过滤：(1) 去除含有超过 10% 未知核苷酸的 reads 和 (2) 去除含有少于 80% 的质量（Q 值）>20 的碱基的 reads。 然后根据重叠超过 10bp 且错配小于 2% 的双端读数之间的重叠，将过滤后的读数组装成标签。 使用软件 Mothur (v.1.34.0) 去除冗余标签以获得唯一标签。 然后使用获得的独特标签来计算丰度。然后我们使用 Greengene 将序列聚类为操作分类单元 (OTU)。 使用 BLAST 与 Greengene 数据库以 97% 的相似性将分类学分配给 OTU，以在属水平（可能的物种水平）识别微生物。 使用无花果树从对齐的代表性 OTU 序列构建系统发育树。景观中的总物种多样性由两个不同的参数决定，即更局部范围内的地点或栖息地的平均物种多样性（alpha 多样性）和这些栖息地之间的差异（贝塔多样性）。 Alpha 多样性包括社区多样性和丰富度：社区丰富度由 ACE 估计器或 Chao1 估计器表示。 Beta 多样性是基于物种进化计算微生物群落结构和成员之间的差异（距离）。 这种距离是用Weighted Unifrac计算出来的，可以用主坐标分析图来表现。

宏基因组分析根据制造商的说明，使用 TruSeq Nano DNA 试剂盒 (FC-121-4002) 构建来自标本的宏基因组 DNA 文库，稍作修改。 简而言之，通过超声处理获得长度一致的DNA（350 bp）。 对 DNA 片段进行末端修复并选择合适的文库大小，然后将样品加 A 尾并连接到接头上。 使用NovaSeq 6000测序系统（Illumina）进行测序和文库验证 测序得到的Raw Data有一定比例的低质量数据，按照以下规则：（1）去除含有10%以上未知核苷酸的reads和（2）去除含有少于 80% 的碱基质量（Q 值）>20。 质控后使用Megahit对序列（clean data）进行拼接，得到contigs。Contigs过滤1000bp以下。 载体和宿主序列通过 BLASTN 过滤，E 值截止值为 1e-5。 剩余的读数通过 SOAP 比对映射到人类基因组，匹配的读数作为污染物从宿主基因组中移除。分类学分类是使用 BLAST 对 NCBI 数据库对组装的重叠群和单体进行的。 最好的 BLAST 命中被用来指代每个序列的分类等级。 所有分析均在 R 中进行，并且使用错误发现率方法对 p 值进行了多次测试校正。