Estudando a diferença entre dois tipos de osteomielite

Indivíduos com osteomielite do pé diabético (grupo Dd) (tamanho da amostra ≥ 10 casos) e indivíduos com osteomielite do pé sem diabetes (grupo ND) (tamanho da amostra ≥ 10 casos) foram coletados de acordo com os critérios de inclusão. Os cirurgiões coletaram espécimes ósseos intraoperatórios de todos os 28 pacientes que necessitaram de intervenção cirúrgica (desbridamento ou amputação) para tratamento de sua osteomielite [10]. Evitou culturas de tecidos moles ou trato sinusal, porque não eram suficientemente precisas na previsão de patógenos ósseos [11]. Após o desbridamento cirúrgico do tecido infectado ou necrótico, limpo com solução salina estéril, os espécimes de ossos profundos foram colhidos usando instrumentos estéreis. Obtivemos rotineiramente espécimes ósseos adequados e os dividimos em três partes. Um para cultura microbiológica de rotina e testes de sensibilidade a antibióticos, um para histopatologia e outro para análise de sequenciamento de DNA. Esse processo de obtenção de espécimes ósseos pode reduzir as chances de contaminação por bactérias colonizadoras do tecido da ferida.

Sequenciamento de alto rendimento do 16S rRNA Dois espécimes foram enviados ao laboratório para cultura convencional e testes histopatológicos. As amostras de osso restantes foram colocadas em tubos estéreis sem qualquer meio de transporte e armazenadas a 4 ℃ por 24 horas e depois congeladas a -80C até a extração do DNA. O DNA genômico foi extraído usando o kit de extração de DNA (YiRui, ShenZhen, China) de acordo com as instruções do fabricante. O DNA extraído foi controlado quantitativo e de qualidade por eletroforese em gel de agarose (JS-power 300, PeiQin, ShangHai, China). Em seguida, amplificamos a região variável V3-V4 do gene 16S rRNA para sequenciamento usando um primer de fusão direta e reversa-（341F：5'-CCTAYGGGRBGCASCAG-3' e 806R：5'-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3）(ABI GeneAmp 9700 PCR Instrumento). Os produtos de PCR foram amplificados removendo sequências curtas, sequências singleton e leituras ruidosas. A reação de PCR foi realizada em um volume total de 60 μl, contendo 6 μl de tampão 10× Ex Tap PCR, 6 μl de mistura dNTP, 0,6 μl de albumina de soro bovino (BSA), 0,3 μl Ex Tag, 1 μl DNA, 1,2 μl primers direto e reverso, e 43,7 μlH 2O. A amplificação por PCR foi realizada nas seguintes condições: a desnaturação inicial foi realizada a 94°C por 5min, seguida de 27 ciclos a 94°C por 30s, 55°C por 30s e 72°C por 45s. Uma extensão final foi realizada a 72°C por 10 minutos a partir de 28 amostras (incluindo pacientes com DFO e SFO) que foram sequenciadas em duas execuções separadas no Illumina Miseq. Para obter leituras limpas de alta qualidade, as leituras brutas foram filtradas de acordo com as seguintes regras: (1) remover leituras contendo mais de 10% de nucleotídeos desconhecidos e (2) remover leituras contendo menos de 80% de bases com qualidade (valor Q)>20. As leituras filtradas foram então montadas em tags de acordo com a sobreposição entre as leituras de extremidades pareadas com mais de 10 pb de sobreposição e menos de 2% de incompatibilidade. O software Mothur (v.1.34.0) foi utilizado para remover as tags redundantes para obter tags únicas. As tags únicas obtidas foram usadas para calcular a abundância. Em seguida, agrupamos as sequências em unidades taxonômicas operacionais (OTUs) usando o Greengene. A taxonomia foi atribuída a OTUs usando o BLAST para o banco de dados Greengene com 97% de similaridade para identificar microorganismos no nível de gênero (nível de espécie sempre que possível). Uma árvore filogenética foi construída a partir de sequências OTU representativas alinhadas usando figueira. A diversidade total de espécies em uma paisagem foi determinada por dois parâmetros diferentes, a diversidade média de espécies em locais ou habitats em uma escala mais local (diversidade alfa) e a diferenciação entre esses habitats (diversidade beta). A diversidade alfa incluiu tanto a diversidade quanto a riqueza da comunidade: a riqueza da comunidade foi representada pelo estimador ACE ou pelo estimador Chao1. A diversidade beta foi o cálculo das diferenças (distância) entre a estrutura da comunidade do microbioma e a associação com base na evolução das espécies. Este tipo de distância foi calculado usando o Weighted Unifrac e pode ser realizado pelo diagrama de Análise de Coordenadas Principais.

Análise de metagenomas Uma biblioteca de DNA de metagenoma de espécimes foi construída usando o kit TruSeq Nano DNA (FC-121-4002) de acordo com as instruções do fabricante, com pequenas modificações. Em resumo, o DNA conformado de comprimento (350 pb) foi obtido por sonicação. Os fragmentos de DNA foram reparados nas extremidades e o tamanho apropriado da biblioteca foi selecionado, então as amostras tiveram cauda A e foram ligadas a adaptadores. Os sistemas de sequenciamento NovaSeq 6000 (Illumina) foram usados ​​para sequenciamento e validação de biblioteca Os dados brutos obtidos por sequenciamento têm uma certa proporção de dados de baixa qualidade de acordo com as seguintes regras: (1) remover leituras contendo mais de 10% de nucleotídeos desconhecidos e (2) remover leituras contendo menos de 80% de bases com qualidade (valor Q)>20 . Megahit foi usado para unir as sequências (dados limpos) após o controle de qualidade e os contigs foram obtidos. Os contigs foram filtrados abaixo de 1000bp. As sequências do vetor e do hospedeiro foram filtradas por BLASTN, com um corte de valor E de 1e-5. As leituras restantes foram mapeadas para o genoma humano por alinhamento SOAP, e as leituras correspondentes foram removidas como sendo contaminantes do genoma do hospedeiro. As classificações taxonômicas foram realizadas em contigs e singletons montados usando BLAST contra o banco de dados NCBI. E o melhor acerto do BLAST foi usado para referir a classificação taxonômica de cada sequência. Todas as análises foram realizadas em R e os valores de p foram corrigidos para testes múltiplos com o método da taxa de descoberta falsa.