Badanie różnic między dwoma rodzajami zapalenia kości i szpiku

Pacjenci z cukrzycowym zapaleniem kości i szpiku (grupa Dd) (wielkość próby ≥ 10 przypadków) i pacjenci z zapaleniem kości i szpiku stopy bez cukrzycy (grupa ND) (wielkość próby ≥ 10 przypadków) zostali zebrani zgodnie z kryteriami włączenia. Chirurdzy pobrali śródoperacyjne próbki kości od wszystkich 28 pacjentów, którzy wymagali interwencji chirurgicznej (oczyszczenie lub amputacja) w celu leczenia zapalenia kości i szpiku [10]. Unikano posiewów tkanek miękkich lub zatok, ponieważ nie były one wystarczająco dokładne w przewidywaniu patogenów kości[11]. Po chirurgicznym oczyszczeniu zakażonej lub martwiczej tkanki, oczyszczonej sterylnym roztworem soli, pobrano próbki głębokiej kości za pomocą sterylnych narzędzi. Rutynowo uzyskaliśmy odpowiednie próbki kości i podzieliliśmy je na trzy części. Jeden do rutynowych posiewów mikrobiologicznych i testów wrażliwości na antybiotyki, jeden do histopatologii, a drugi do analizy sekwencjonowania DNA. Ten proces uzyskiwania próbek kości może zmniejszyć ryzyko zakażenia bakteriami kolonizującymi tkankę rany.

Wysokowydajne sekwencjonowanie 16S rRNA Dwie próbki wysłano do laboratorium w celu przeprowadzenia konwencjonalnej hodowli i badań histopatologicznych. Pozostawioną próbkę kości umieszczono w sterylnych rurkach bez żadnego podłoża transportowego i przechowywano w temperaturze 4 ℃ przez 24 godziny, a następnie zamrożono w temperaturze -80°C aż do ekstrakcji DNA. Genomowy DNA ekstrahowano przy użyciu zestawu do ekstrakcji DNA (YiRui, ShenZhen, Chiny) zgodnie z instrukcjami producenta. Wyekstrahowany DNA poddano kontroli ilościowej i jakościowej za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym (JS-power 300, PeiQin, ShangHai, Chiny). Następnie amplifikowaliśmy region zmienny V3-V4 genu 16S rRNA do sekwencjonowania przy użyciu startera fuzyjnego do przodu i do tyłu - (341F: 5'-CCTAYGGGRBGCASCAG-3' i 806R: 5'-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3) (ABI GeneAmp 9700 PCR Instrument). Produkty PCR amplifikowano przez usunięcie krótkich sekwencji, sekwencji pojedynczych i zaszumionych odczytów. Reakcję PCR przeprowadzono w całkowitej objętości 60 μl, zawierającej 6 μl 10× buforu Ex Tap PCR, 6 μl mieszaniny dNTP, 0,6 μl albuminy surowicy bydlęcej (BSA), 0,3 μl Ex Tag, 1 μl DNA, 1,2 μl startery do przodu i do tyłu oraz 43,7 μlH 2O. Amplifikację PCR prowadzono w następujących warunkach: wstępną denaturację prowadzono w 94°C przez 5 min, po czym następowało 27 cykli w 94°C przez 30s, 55°C przez 30s i 72°C przez 45s. Końcowe wydłużanie przeprowadzono w 72°C przez 10 minut z 28 próbek (w tym pacjentów z DFO i SFO) zsekwencjonowanych w dwóch oddzielnych przebiegach na Illumina Miseq. Aby uzyskać czyste odczyty wysokiej jakości, surowe odczyty filtrowano zgodnie z następującymi zasadami: (1) usuń odczyty zawierające więcej niż 10% nieznanych nukleotydów i (2) usuń odczyty zawierające mniej niż 80% zasad o jakości (wartość Q)> 20. Przefiltrowane odczyty zostały następnie połączone w znaczniki zgodnie z nakładaniem się odczytów sparowanych końców z nakładaniem się ponad 10 pz i niedopasowaniem mniejszym niż 2%. Oprogramowanie Mothur (wersja 1.34.0) zostało użyte do usunięcia zbędnych tagów w celu uzyskania unikalnych tagów. Uzyskane unikalne znaczniki zostały następnie wykorzystane do obliczenia liczebności. Następnie pogrupowaliśmy sekwencje w operacyjne jednostki taksonomiczne (OTU) za pomocą Greengene. Taksonomia została przypisana do OTU przy użyciu BLAST do bazy danych Greengene z 97% podobieństwem w celu identyfikacji mikroorganizmów na poziomie rodzajów (jeśli to możliwe na poziomie gatunku). Drzewo filogenetyczne zostało zbudowane z wyrównanych reprezentatywnych sekwencji OTU przy użyciu drzewa figowego. Całkowita różnorodność gatunkowa w krajobrazie została określona przez dwa różne parametry, średnią różnorodność gatunkową w miejscach lub siedliskach w skali bardziej lokalnej (różnorodność alfa) oraz zróżnicowanie między tymi siedliskami (różnorodność beta). Różnorodność alfa obejmowała zarówno różnorodność, jak i bogactwo społeczności: bogactwo społeczności było reprezentowane przez estymator ACE lub estymator Chao1. Różnorodność beta polegała na obliczeniu różnic (odległości) między strukturą społeczności mikrobiomów a członkostwem w oparciu o ewolucję gatunków. Ten rodzaj odległości został obliczony za pomocą Weighted Unifrac i może być wykonany za pomocą diagramu analizy głównych współrzędnych.

Analiza metagenomów Biblioteki metagenomu DNA z próbek skonstruowano przy użyciu zestawu TruSeq Nano DNA (FC-121-4002) zgodnie z instrukcjami producenta, z niewielkimi modyfikacjami. W skrócie, DNA o zgodnej długości (350 pz) otrzymano przez sonikację. Fragmenty DNA poddano naprawie na końcach i wybrano odpowiednią wielkość biblioteki, następnie próbki oznaczono ogonem A i zligowano z adapterami. Systemy sekwencjonowania NovaSeq 6000 （Illumina） zostały użyte do sekwencjonowania i walidacji bibliotek. Surowe dane uzyskane w wyniku sekwencjonowania zawierają pewną część danych niskiej jakości zgodnie z następującymi zasadami: (1) usuń odczyty zawierające więcej niż 10% nieznanych nukleotydów oraz (2) usuń odczyty zawierające mniej niż 80% zasad o jakości (wartość Q) >20 . Megahit użyto do splicingu sekwencji (czystych danych) po kontroli jakości i uzyskano kontigi. Kontigi przefiltrowano poniżej 1000 bp. Sekwencje wektora i gospodarza przefiltrowano przez BLASTN, z wartością odcięcia E 1e-5. Pozostałe odczyty zmapowano do ludzkiego genomu przez dopasowanie SOAP, a pasujące odczyty usunięto jako zanieczyszczenia z genomu gospodarza. Klasyfikacje taksonomiczne przeprowadzono na zmontowanych kontigach i singletonach przy użyciu BLAST w bazie danych NCBI. A najlepsze trafienie BLAST zostało użyte do odniesienia rangi taksonomicznej każdej sekwencji. Wszystkie analizy przeprowadzono w wartościach R, a wartości p zostały skorygowane o wielokrotne testowanie metodą fałszywego wskaźnika wykrywalności.