Изучение разницы между двумя видами остеомиелита

Субъекты с диабетическим остеомиелитом стопы (группа Dd) (размер выборки ≥ 10 случаев) и субъекты с остеомиелитом стопы без диабета (группа ND) (размер выборки ≥ 10 случаев) были собраны в соответствии с критериями включения. Хирурги собрали интраоперационные образцы кости у всех 28 пациентов, которым потребовалось хирургическое вмешательство (санация или ампутация) для лечения остеомиелита [10]. Избегали культур мягких тканей или носовых пазух, потому что они не были достаточно точными для прогнозирования костных патогенов [11]. После хирургической обработки инфицированных или некротизированных тканей, очищенных стерильным физиологическим раствором, с помощью стерильных инструментов были взяты образцы глубоких костей. Мы обычно получали адекватные образцы костей и разделяли их на три части. Один для рутинного микробиологического посева и тестирования чувствительности к антибиотикам, один для гистопатологии, а другой для анализа секвенирования ДНК. Этот процесс получения образцов костей может снизить вероятность заражения бактериями, колонизирующими раневую ткань.

Высокопроизводительное секвенирование 16S рРНК Два образца были отправлены в лабораторию для обычного культивирования и гистопатологических тестов. Оставшийся образец кости помещали в стерильные пробирки без какой-либо транспортной среды и хранили при 4°С в течение 24 часов, а затем замораживали при -80°С до выделения ДНК. Геномную ДНК экстрагировали с использованием набора для выделения ДНК (YiRui, ShenZhen, China) в соответствии с инструкциями производителя. Экстрагированную ДНК количественно и качественно контролировали электрофорезом в агарозном геле (JS-power 300, PeiQin, Шанхай, Китай). Затем мы амплифицировали вариабельную область V3-V4 гена 16S рРНК для секвенирования с использованием прямого и обратного праймеров слияния (341F: 5'-CCTAYGGGRBGCASCAG-3' и 806R: 5'-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3) (ABI GeneAmp 9700 PCR). Инструмент). Продукты ПЦР амплифицировали путем удаления коротких последовательностей, одноэлементных последовательностей и прочтений с шумами. Реакцию ПЦР проводили в общем объеме 60 мкл, содержащем 6 мкл 10× буфера Ex Tap для ПЦР, 6 мкл смеси dNTP, 0,6 мкл бычьего сывороточного альбумина (БСА), 0,3 мкл Ex Tag, 1 мкл ДНК, 1,2 мкл прямой и обратный праймеры и 43,7 мкл H 2 O. ПЦР-амплификацию проводили в следующих условиях: начальную денатурацию проводили при 94°С в течение 5 мин, после чего следовали 27 циклов при 94°С в течение 30 с, 55°С в течение 30 с и 72°С в течение 45 с. Окончательное удлинение выполняли при 72°C в течение 10 минут из 28 образцов (включая пациентов с DFO и SFO), секвенированных в ходе двух отдельных циклов на Illumina Miseq. Для получения качественных чистых прочтений необработанные прочтения фильтровались по следующим правилам: (1) удалять прочтения, содержащие более 10 % неизвестных нуклеотидов и (2) удалять прочтения, содержащие менее 80 % оснований с качеством (значение Q)>20. Затем отфильтрованные чтения были собраны в теги в соответствии с перекрытием между чтениями с парными концами с перекрытием более 10 пар оснований и несоответствием менее 2%. Программное обеспечение Mothur (v.1.34.0) использовалось для удаления избыточных тегов для получения уникальных тегов. Затем полученные уникальные теги использовались для расчета численности. Затем мы сгруппировали последовательности в операционные таксономические единицы (OTU) с помощью Greengene. Таксономия была присвоена OTU с использованием BLAST в базе данных Greengene при сходстве 97% для идентификации микроорганизмов на уровне родов (по возможности на уровне видов). Филогенетическое дерево было построено из выровненных репрезентативных последовательностей OTU с использованием figtree. Общее видовое разнообразие в ландшафте определялось двумя различными параметрами: средним видовым разнообразием на участках или в местах обитания в более локальном масштабе (альфа-разнообразие) и дифференциацией среди этих местообитаний. (бета-разнообразие). Альфа-разнообразие включало как разнообразие, так и богатство сообщества: богатство сообщества было представлено оценкой ACE или оценкой Chao1. Бета-разнообразие представляло собой расчет различий (расстояний) между структурой сообщества микробиома и его членством на основе эволюции видов. Этот тип расстояния был рассчитан с использованием взвешенного Unifrac и может быть выполнен с помощью диаграммы анализа основных координат.

Анализ метагеномов Библиотеки метагеномной ДНК из образцов были сконструированы с использованием набора TruSeq Nano DNA (FC-121-4002) в соответствии с инструкциями производителя с небольшими изменениями. Вкратце, ДНК соответствующей длины (350 п.н.) была получена путем обработки ультразвуком. Фрагменты ДНК подвергали репарации концов и выбирали соответствующий размер библиотеки, затем к образцам присоединяли А-хвост и лигировали с адаптерами. Системы секвенирования NovaSeq 6000 (Illumina) использовались для секвенирования и проверки библиотеки. Необработанные данные, полученные в результате секвенирования, содержат определенную долю данных низкого качества в соответствии со следующими правилами: (1) удалять чтения, содержащие более 10% неизвестных нуклеотидов и (2) удалять чтения, содержащие менее 80% баз с качеством (значение Q)>20. Megahit использовали для сплайсинга последовательностей (чистые данные) после контроля качества, и были получены контиги. Контиги были отфильтрованы ниже 1000 п.н. Последовательности вектора и хозяина были отфильтрованы с помощью BLASTN с порогом Е-значения 1e-5. Оставшиеся чтения были сопоставлены с геномом человека с помощью выравнивания SOAP, а совпадающие чтения были удалены как примеси из генома хозяина. Таксономическая классификация была выполнена на собранных контигах и одиночках с использованием BLAST против базы данных NCBI. И лучший результат BLAST использовался для обозначения таксономического ранга каждой последовательности. Все анализы были выполнены в R, а значения p были скорректированы для многократного тестирования с использованием метода частоты ложных открытий.