Onderzoek naar het verschil tussen twee soorten osteomyelitis

Diabetische voetosteomyelitis (Dd-groep) proefpersonen (steekproefgrootte ≥ 10 gevallen) en voetosteomyelitis zonder diabetes (ND-groep) proefpersonen (steekproefgrootte ≥ 10 gevallen) werden verzameld in overeenstemming met de inclusiecriteria. Chirurgen verzamelden intra-operatieve botspecimens van alle 28 patiënten die een chirurgische ingreep (debridement of amputatie) nodig hadden voor de behandeling van hun osteomyelitis[10]. Weke delen of sinuskanaalculturen vermeden, omdat ze niet voldoende nauwkeurig waren in het voorspellen van botpathogenen [11]. Na chirurgisch debridement van geïnfecteerd of necrotisch weefsel, gereinigd met een steriele zoutoplossing, werden diepe botspecimens geoogst met behulp van steriele instrumenten. We verkregen routinematig adequate botspecimens en verdeelden ze in drie delen. Een voor routinematige microbiologische kweek en gevoeligheidstesten voor antibiotica, een voor de histopathologie en de andere voor analyse van de DNA-sequentie. Dit proces om botspecimens te verkrijgen, zou de kans op besmetting door wondweefselkoloniserende bacteriën kunnen verkleinen.

16S rRNA high-throughput sequencing Twee monsters werden naar het laboratorium gestuurd voor conventioneel kweken en histopathologische tests. Het overgebleven botmonster werd zonder transportmedium in steriele pijpen geplaatst en gedurende 24 uur bij 4°C bewaard en vervolgens ingevroren bij -80°C tot DNA-extractie. Genomisch DNA werd geëxtraheerd met behulp van de DNA-extractiekit (YiRui, ShenZhen, China) volgens de instructies van de fabrikant. Geëxtraheerd DNA was kwantitatieve en kwaliteitscontrole door agarosegelelektroforese (JS-power 300, PeiQin, ShangHai, China). Vervolgens amplificeerden we het V3-V4 variabele gebied van het 16S rRNA-gen voor sequentiebepaling met behulp van een voorwaartse en een omgekeerde fusieprimer-（341F：5'-CCTAYGGGRBGCASCAG-3' en 806R：5'-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3）(ABI GeneAmp 9700 PCR Instrument). PCR-producten werden geamplificeerd door korte sequenties, singleton-sequenties en luidruchtige aflezingen te verwijderen. De PCR-reactie werd uitgevoerd in een totaal volume van 60 μl, bevattende 6 μl 10 x Ex Tap PCR-buffer, 6 μl dNTP-mengsel, 0,6 μl runderserumalbumine (BSA), 0,3 μl Ex Tag, 1 μl DNA, 1,2 μl voorwaartse en achterwaartse primers en 43,7 μlH 2O. De PCR-amplificatie werd uitgevoerd onder de volgende omstandigheden: initiële denaturatie werd uitgevoerd bij 94°C gedurende 5 minuten, gevolgd door 27 cycli bij 94°C gedurende 30 seconden, 55°C gedurende 30 seconden en 72°C gedurende 45 seconden. Een laatste verlenging werd uitgevoerd bij 72 °C gedurende 10 minuten van 28 monsters (inclusief DFO- en SFO-patiënten) waarvan de sequentie werd bepaald over twee afzonderlijke runs op Illumina Miseq. Om zuivere uitlezingen van hoge kwaliteit te krijgen, werden onbewerkte uitlezingen gefilterd volgens de volgende regels: (1) verwijder uitlezingen die meer dan 10% onbekende nucleotiden bevatten en (2) verwijder uitlezingen die minder dan 80% basen bevatten met een kwaliteit (Q-waarde)>20. De gefilterde reads werden vervolgens geassembleerd tot tags op basis van overlap tussen paired-end reads met meer dan 10 bp overlap en minder dan 2% mismatch. De software Mothur (v.1.34.0) werd gebruikt om de overtollige tags te verwijderen om unieke tags te krijgen. De verkregen unieke tags werden vervolgens gebruikt om de overvloed te berekenen. Vervolgens hebben we sequenties geclusterd in operationele taxonomische eenheden (OTU's) met behulp van de Greengene. Taxonomie werd toegewezen aan OTU's met behulp van de BLAST naar de Greengene-database met 97% gelijkenis om micro-organismen op geslachtsniveau te identificeren (waar mogelijk op soortniveau). Een fylogenetische boom werd opgebouwd uit uitgelijnde representatieve OTU-sequenties met behulp van vijgenboom. De totale soortendiversiteit in een landschap werd bepaald door twee verschillende parameters, de gemiddelde soortendiversiteit in locaties of habitats op een meer lokale schaal (alfa-diversiteit) en de differentiatie tussen die habitats (bèta-diversiteit). Alfa-diversiteit omvatte zowel gemeenschapsdiversiteit als rijkdom: gemeenschapsrijkdom werd weergegeven door de ACE-schatter of de Chao1-schatter. Beta-diversiteit was de berekening van verschillen (afstand) tussen de structuur van de microbioomgemeenschap en het lidmaatschap op basis van de evolutie van soorten. Dit soort afstand is berekend met behulp van Weighted Unifrac en kan worden uitgevoerd met een Principal Coordinates Analysis-diagram.

Metagenomen-analyse Een metagenoom-DNA-bibliotheek van monsters werd geconstrueerd met behulp van TruSeq Nano DNA-kit (FC-121-4002) volgens de instructies van de fabrikant, met kleine aanpassingen. In het kort, het lengteconforme DNA (350 bp) werd verkregen door sonicatie. DNA-fragmenten werden aan het uiteinde gerepareerd en de juiste bibliotheekgrootte werd geselecteerd, vervolgens werden de monsters A-staartig gemaakt en aan adapters geligeerd. De NovaSeq 6000-sequentiëringssystemen (Illumina) werden gebruikt voor sequentiëring en bibliotheekvalidatie. Ruwe gegevens verkregen door sequentiëring hebben een bepaalde hoeveelheid gegevens van lage kwaliteit volgens de volgende regels: (1) verwijder uitlezingen die meer dan 10% onbekende nucleotiden bevatten en (2) verwijder uitlezingen die meer dan 10% onbekende nucleotiden bevatten minder dan 80% van de basen met kwaliteit (Q-waarde)>20 . Megahit werd gebruikt om de sequenties te splitsen (schone gegevens) na kwaliteitscontrole, en contigs werden verkregen. Contigs werden gefilterd onder 1000bp. De vector- en gastheersequenties werden gefilterd door BLASTN, met een E-waardegrens van 1e-5. De resterende reads werden toegewezen aan het menselijk genoom door SOAP-uitlijning en de overeenkomende reads werden verwijderd als zijnde verontreinigingen uit het gastheergenoom. De taxonomische classificaties werden uitgevoerd op geassembleerde contigs en singletons met behulp van BLAST tegen de NCBI-database. En de beste BLAST-hit werd gebruikt om naar de taxonomische rangorde van elke reeks te verwijzen. Alle analyses zijn uitgevoerd in R- en p-waarden zijn gecorrigeerd voor meervoudige testen met de false discovery rate-methode.