Studera om skillnaden mellan två typer av osteomyelit

Patienter med diabetesfot osteomyelit (Dd-grupp) (provstorlek ≥ 10 fall) och fotosteomyelit utan diabetes (ND-grupp) patienter (provstorlek ≥ 10 fall) samlades in i enlighet med inklusionskriterierna. Kirurger tog intraoperativa benprover från alla 28 patienter som behövde kirurgiskt ingrepp (debridering eller amputation) för att hantera sin osteomyelit[10]. Undvek odlingar av mjukvävnad eller sinuskanal, eftersom de inte var tillräckligt exakta för att förutsäga benpatogener[11]. Efter kirurgisk debridering av infekterad eller nekrotisk vävnad, renad med steril koksaltlösning, skördades djupa benprover med hjälp av sterila instrument. Vi fick rutinmässigt adekvata benprover och delade upp dem i tre delar. En för rutinmässig mikrobiologisk odling och testning av antibiotikakänslighet, en för histopatologi och den andra för DNA-sekvensanalys. Denna process för att erhålla benprover kan minska risken för kontaminering av sårvävnadskoloniserande bakterier.

16S rRNA high-throughput sekvensering Två prover skickades till laboratoriet för konventionell odling och histopatologiska tester. Benprovet som lämnades placerades i sterila rör utan transportmedium och förvarades vid 4°C i 24 timmar och frystes sedan vid -80°C tills DNA-extraktion. Genomiskt DNA extraherades med hjälp av DNA-extraktionskit (YiRui, ShenZhen, Kina) enligt tillverkarens instruktioner. Extraherat DNA var kvantitativt och kvalitetskontroll genom agarosgelelektrofores (JS-power 300, PeiQin, Shanghai, Kina). Sedan amplifierade vi den variabla V3-V4-regionen av 16S rRNA-genen för sekvensering med en framåt- och en omvänd fusionsprimer-(341F：5'-CCTAYGGGRBGCASCAG-3' och 806R：5'-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3)(ABI Gene 0AmpR) Instrument). PCR-produkter amplifierades genom att ta bort korta sekvenser, singletonsekvenser och brusiga avläsningar. PCR-reaktionen utfördes i en total volym av 60 μl, innehållande 6 μl 10x Ex Tap PCR-buffert, 6 μl dNTP-blandning, 0,6 μl bovint serumalbumin (BSA), 0,3 μl Ex Tag, 1μl DNA, 1,2 μl framåt och bakåt primers och 43,7 μlH 2O. PCR-amplifieringen utfördes under följande betingelser: initial denaturering utfördes vid 94°C i 5 min, vilket följdes av 27 cykler vid 94°C i 30 s, 55°C i 30 s och 72°C under 45 s. En sista förlängning utfördes vid 72°C i 10 minuter från 28 prover (inklusive DFO- och SFO-patienter) sekvenserades över två separata körningar på Illumina Miseq. För att få rena avläsningar av hög kvalitet filtrerades råavläsningar enligt följande regler: (1) ta bort avläsningar som innehåller mer än 10 % okända nukleotider och (2) ta bort avläsningar som innehåller mindre än 80 % av baserna med kvalitet (Q-värde)>20. De filtrerade avläsningarna sattes sedan ihop till taggar enligt överlappning mellan parade avläsningar med mer än 10 bp överlappning och mindre än 2 % oöverensstämmelse. Mjukvaran Mothur (v.1.34.0) användes för att ta bort de redundanta taggarna för att få unika taggar. De erhållna unika taggarna användes sedan för att beräkna mängden. Sedan klustrade vi sekvenser till operationella taxonomiska enheter (OTU) med hjälp av Greengene. Taxonomien tilldelades OTU:er med hjälp av BLASTto Greengene-databasen med 97% likhet för att identifiera mikroorganismer på släktnivå (artnivå där det är möjligt). Ett fylogenetiskt träd byggdes av upplinjerade representativa OTU-sekvenser med hjälp av fikonträd. Den totala artdiversiteten i ett landskap bestämdes av två olika parametrar, den genomsnittliga artdiversiteten i platser eller livsmiljöer i en mer lokal skala (alfadiversitet) och differentieringen mellan dessa livsmiljöer (beta mångfald). Alfa-mångfald inkluderade både gemenskapsmångfald och rikedom: gemenskapsrikedom representerades av ACE-estimatorn eller Chao1-estimatorn. Beta-diversitet var beräkningen av skillnader (avstånd) mellan mikrobiomsamhällets struktur och medlemskap baserat på arternas utveckling. Denna typ av avstånd beräknades med hjälp av Weighted Unifrac och kan utföras av Principal Co-ordinates Analysis diagram.

Metagenomanalys Ett metagenom-DNA-bibliotek från prover konstruerades med användning av TruSeq Nano DNA-kit (FC-121-4002) enligt tillverkarens instruktioner, med små modifieringar. I korthet erhölls längden anpassat DNA (350 bp) genom sonikering. DNA-fragment änd-reparerades och den lämpliga biblioteksstorleken valdes, sedan A-svansade proverna och ligerades till adaptrar. NovaSeq 6000 sekvenseringssystem (Illumina) användes för sekvensering och biblioteksvalidering. Rådata som erhållits genom sekvensering har en viss andel lågkvalitetsdata enligt följande regler: (1) ta bort läsningar som innehåller mer än 10 % okända nukleotider och (2) ta bort läsvärden mindre än 80 % av baserna med kvalitet (Q-värde)>20 . Megahit användes för att splitsa sekvenserna (rena data) efter kvalitetskontroll, och contigs erhölls. Contigs filtrerades under 1000 bp. Vektor- och värdsekvenserna filtrerades med BLASTN, med ett E-värde cutoff på 1e-5. De återstående läsningarna kartlades till det mänskliga genomet genom SOAP-anpassning, och de matchande läsningarna togs bort som kontaminanter från värdgenomet. De taxonomiska klassificeringarna utfördes på sammansatta contigs och singletons med hjälp av BLAST mot NCBI-databasen. Och den bästa BLAST-träffen användes för att referera till den taxonomiska rangordningen för varje sekvens. Alla analyser har utförts i R och p-värden korrigerades för flera tester med metoden för falsk upptäcktshastighet.