Undersøgelse af forskellen mellem to slags osteomyelitis

Patienter med diabetisk fod osteomyelitis (Dd gruppe) (prøvestørrelse ≥ 10 tilfælde) og fod osteomyelitis uden diabetes (ND gruppe) forsøgspersoner (prøvestørrelse ≥ 10 tilfælde) blev indsamlet i overensstemmelse med inklusionskriterierne. Kirurger indsamlede intraoperative knogleprøver fra alle 28 patienter, som krævede kirurgisk indgreb (debridement eller amputation) for at håndtere deres osteomyelitis[10]. Undgåede kulturer af blødt væv eller sinuskanal, fordi de ikke var tilstrækkelig nøjagtige til at forudsige knoglepatogener[11]. Efter kirurgisk debridering af inficeret eller nekrotisk væv, renset med steril saltvandsopløsning, blev dybe knogleprøver høstet ved hjælp af sterile instrumenter. Vi fik rutinemæssigt tilstrækkelige knogleprøver og delte dem i tre dele. En til rutinemæssig mikrobiologisk kultur og antibiotikafølsomhedstestning, en til histopatologi og den anden til DNA-sekventeringsanalyse. Denne proces til at få knogleprøver kan reducere chancerne for kontaminering af sårvævskoloniserende bakterier.

16S rRNA high-throughput sekventering To prøver blev sendt til laboratoriet til konventionel dyrkning og histopatologiske tests. Knogleprøven, der var tilbage, blev anbragt i sterile rør uden transportmedium og opbevaret ved 4 ℃ i 24 timer og derefter frosset ved -80 C indtil DNA-ekstraktion. Genomisk DNA blev ekstraheret ved hjælp af DNA-ekstraktionssæt (YiRui, ShenZhen, Kina) i henhold til producentens instruktioner. Ekstraheret DNA var kvantitativ og kvalitetskontrol ved agarosegelelektroforese (JS-power 300, PeiQin, Shanghai, Kina). Derefter amplificerede vi den variable V3-V4-region af 16S rRNA-genet til sekventering ved hjælp af en fremadrettet og en omvendt fusionsprimer-(341F：5'-CCTAYGGGRBGCASCAG-3' og 806R：5'-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3）(ABI Gene PCR) Instrument). PCR-produkter blev amplificeret ved at fjerne korte sekvenser, singleton-sekvenser og støjende læsninger. PCR-reaktionen blev udført i et samlet volumen på 60 μl, indeholdende 6 μl 10× Ex Tap PCR-buffer, 6 μl dNTP-blanding, 0,6 μl bovint serumalbumin (BSA), 0,3 μl Ex Tag, 1μl DNA, 1,2 μl frem og tilbage primere og 43,7 μlH 2O. PCR-amplifikationen blev udført under følgende betingelser: initial denaturering blev udført ved 94°C i 5 minutter, som blev efterfulgt af 27 cyklusser ved 94°C i 30 sekunder, 55°C i 30 sekunder og 72°C i 45 sekunder. En sidste forlængelse blev udført ved 72°C i 10 minutter fra 28 prøver (inklusive DFO- og SFO-patienter) blev sekventeret over to separate kørsler på Illumina Miseq. For at få rene aflæsninger af høj kvalitet, blev rålæsninger filtreret i henhold til følgende regler: (1) fjern aflæsninger indeholdende mere end 10 % ukendte nukleotider og (2) fjern aflæsninger indeholdende mindre end 80 % af baser med kvalitet (Q-værdi)>20. De filtrerede læsninger blev derefter samlet til tags i overensstemmelse med overlap mellem parrede ende-læsninger med mere end 10 bp overlap og mindre end 2 % mismatch. Softwaren Mothur (v.1.34.0) blev brugt til at fjerne de overflødige tags for at få unikke tags. De opnåede unikke tags blev derefter brugt til at beregne mængden. Derefter grupperede vi sekvenser i operationelle taksonomiske enheder (OTU'er) ved hjælp af Greengene. Taksonomi blev tildelt OTU'er ved hjælp af BLAST til Greengene-databasen med 97% lighed for at identificere mikroorganismer på slægtsniveau (artsniveau, hvor det er muligt). Et fylogenetisk træ blev bygget ud fra afstemte repræsentative OTU-sekvenser ved hjælp af figentræ. Den samlede artsdiversitet i et landskab blev bestemt af to forskellige parametre, den gennemsnitlige artsdiversitet i lokaliteter eller habitater i en mere lokal skala (alfa-diversitet) og differentieringen mellem disse habitater (beta diversitet). Alfa-diversitet inkluderede både samfundsdiversitet og rigdom: Fællesskabsrigdom blev repræsenteret af ACE-estimatoren eller Chao1-estimatoren. Beta-diversitet var beregningen af ​​forskelle (afstand) mellem mikrobiomsamfundsstruktur og medlemskab baseret på arternes udvikling. Denne form for afstand blev beregnet ved hjælp af Weighted Unifrac og kan udføres af Principal Co-ordinates Analysis diagram.

Metagenomanalyse Et metagenom-DNA-biblioteker fra prøver blev konstrueret ved hjælp af TruSeq Nano DNA-kit (FC-121-4002) i henhold til producentens instruktioner, med små modifikationer. Kort fortalt blev det længdetilpassede DNA (350 bp) opnået ved sonikering. DNA-fragmenter blev enderepareret, og den passende biblioteksstørrelse blev udvalgt, derefter blev prøverne A-halede og ligeret til adaptorer. NovaSeq 6000 sekventeringssystemerne (Illumina) blev brugt til sekventering og biblioteksvalidering. Rådata opnået ved sekventering har en vis andel af data af lav kvalitet i henhold til følgende regler: (1) fjern læsninger, der indeholder mere end 10 % af ukendte nukleotider, og (2) fjern læsninger mindre end 80 % af baser med kvalitet (Q-værdi) >20 . Megahit blev brugt til at splejse sekvenserne (rene data) efter kvalitetskontrol, og der blev opnået contigs. Contigs blev filtreret under 1000bp. Vektor- og værtssekvenserne blev filtreret med BLASTN med en E-værdi cutoff på 1e-5. De resterende læsninger blev kortlagt til det humane genom ved SOAP-justering, og de matchende læsninger blev fjernet som værende kontaminanter fra værtsgenomet. De taksonomiske klassifikationer blev udført på samlede contigs og singletons ved hjælp af BLAST mod NCBI-databasen. Og det bedste BLAST-hit blev brugt til at henvise til den taksonomiske rangering af hver sekvens. Alle analyserne er blevet udført i R og p-værdier blev korrigeret for multiple test med metoden med falsk opdagelseshastighed.