Studium rozdílu mezi dvěma druhy osteomyelitidy

Subjekty s diabetickou osteomyelitidou nohy (skupina Dd) (velikost vzorku ≥ 10 případů) a subjekty s osteomyelitidou nohy bez diabetu (skupina ND) (velikost vzorku ≥ 10 případů) byly shromážděny v souladu s kritérii zařazení. Chirurgové odebrali intraoperační kostní vzorky od všech 28 pacientů, kteří vyžadovali chirurgický zákrok (debridement nebo amputaci) k léčbě osteomyelitidy[10]. Vyhýbali se kulturám měkkých tkání nebo sinusových cest, protože nebyly dostatečně přesné při predikci kostních patogenů[11]. Po chirurgickém debridementu infikované nebo nekrotické tkáně, vyčištěné sterilním fyziologickým roztokem, byly vzorky hluboké kosti odebrány pomocí sterilních nástrojů. Rutinně jsme získávali adekvátní vzorky kostí a rozdělili je do tří částí. Jeden pro rutinní mikrobiologickou kultivaci a testování citlivosti na antibiotika, jeden pro histopatologii a druhý pro analýzu sekvenování DNA. Tento proces získávání vzorků kostí by mohl snížit pravděpodobnost kontaminace bakteriemi kolonizujícími tkáň rány.

Vysoce výkonné sekvenování 16S rRNA Dva vzorky byly odeslány do laboratoře pro konvenční kultivaci a histopatologické testy. Ponechané kostní vzorky byly umístěny do sterilních zkumavek bez jakéhokoli transportního média a skladovány při 4 °C po dobu 24 hodin a poté zmrazeny při -80 °C až do extrakce DNA. Genomová DNA byla extrahována pomocí DNA extrakční soupravy (YiRui, ShenZhen, Čína) podle pokynů výrobce. Extrahovaná DNA byla kvantitativní a kvalitativní kontrola pomocí elektroforézy na agarózovém gelu (JS-power 300, PeiQin, ShangHai, Čína). Poté jsme amplifikovali variabilní oblast V3-V4 genu 16S rRNA pro sekvenování pomocí primeru pro dopřednou a reverzní fúzi-（341F：5'-CCTAYGGGRBGCASCAG-3' a 806R：5'-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3）00ABI GeneAmp9 PCR Nástroj). Produkty PCR byly amplifikovány odstraněním krátkých sekvencí, singletonových sekvencí a zašuměných čtení. PCR reakce byla provedena v celkovém objemu 60 μl, obsahující 6 μl 10× Ex Tap PCR pufru, 6 μl směsi dNTP, 0,6 μl bovinního sérového albuminu (BSA), 0,3 μl Ex Tag, 1 μl DNA, 1,2 μl dopředné a reverzní primery a 43,7 μlH 2O. PCR amplifikace byla prováděna za následujících podmínek: počáteční denaturace byla prováděna při 94 °C po dobu 5 minut, po které následovalo 27 cyklů při 94 °C po dobu 30 s, 55 °C po dobu 30 s a 72 °C po dobu 45 s. Konečné prodloužení bylo provedeno při 72 °C po dobu 10 minut z 28 vzorků (včetně pacientů s DFO a SFO) bylo sekvenováno ve dvou samostatných cyklech na Illumina Miseq. Pro získání vysoce kvalitních čistých čtení byla nezpracovaná čtení filtrována podle následujících pravidel: (1) odstraňte čtení obsahující více než 10 % neznámých nukleotidů a (2) odstraňte čtení obsahující méně než 80 % bází s kvalitou (hodnota Q) >20. Filtrovaná čtení byla poté sestavena do značek podle překrývání mezi čteními na párovaných koncích s přesahem více než 10 bp a méně než 2% nesouladem. Software Mothur (v.1.34.0) byl použit k odstranění nadbytečných značek a získání jedinečných značek. Získané jedinečné značky byly poté použity k výpočtu abundance. Poté jsme seskupili sekvence do operačních taxonomických jednotek (OTU) pomocí Greengene. Taxonomie byla přiřazena OTU pomocí databáze BLAST k databázi Greengene s 97% podobností k identifikaci mikroorganismů na úrovni rodů (kde to bylo možné na úrovni druhu). Fylogenetický strom byl postaven ze zarovnaných reprezentativních sekvencí OTU pomocí fíkovníku. Celková druhová diverzita v krajině byla určena dvěma různými parametry, průměrnou druhovou diverzitou v lokalitách nebo stanovištích v lokálnějším měřítku (alfa diverzita) a diferenciací mezi těmito stanovišti. (beta diverzita). Alfa diverzita zahrnovala jak komunitní diverzitu, tak bohatost: komunitní bohatost reprezentoval ACE estimator nebo Chao1 estimator. Beta diverzita byl výpočet rozdílů (vzdáleností) mezi strukturou společenstva mikrobiomu a členstvím na základě evoluce druhů. Tento druh vzdálenosti byl vypočítán pomocí Weighted Unifrac a lze jej provést pomocí diagramu analýzy hlavních souřadnic.

Analýza metagenomů Knihovny metagenomové DNA ze vzorků byly zkonstruovány pomocí soupravy TruSeq Nano DNA kit (FC-121-4002) podle pokynů výrobce s mírnými úpravami. Stručně řečeno, délkou konformní DNA (350 bp) byla získána sonikací. Fragmenty DNA byly opraveny na konci a byla vybrána vhodná velikost knihovny, poté byly vzorky zakončeny A a ligovány do adaptérů. K sekvenování a validaci knihoven byly použity sekvenační systémy NovaSeq 6000 (Illumina) Nezpracovaná data získaná sekvenováním mají určitý podíl nekvalitních dat podle následujících pravidel: (1) odstranit čtení obsahující více než 10 % neznámých nukleotidů a (2) odstranit čtení obsahující méně než 80 % bází s kvalitou (Q-hodnota)>20 . Megahit byl použit pro sestřih sekvencí (čistá data) po kontrole kvality a byly získány kontigy. Kontigy byly filtrovány pod 1000 bp. Vektorové a hostitelské sekvence byly filtrovány pomocí BLASTN s hraniční hodnotou E le-5. Zbývající čtení byla mapována do lidského genomu zarovnáním SOAP a odpovídající čtení byla odstraněna jako kontaminanty z hostitelského genomu. Taxonomické klasifikace byly prováděny na sestavených kontigech a singletonech pomocí BLAST proti databázi NCBI. A nejlepší zásah BLAST byl použit k odkazování na taxonomickou hodnost každé sekvence. Všechny analýzy byly provedeny v hodnotách R a p byly korigovány pro vícenásobné testování metodou falešného objevu.