Étudier la différence entre deux types d'ostéomyélite

Les sujets atteints d'ostéomyélite du pied diabétique (groupe Dd) (taille d'échantillon ≥ 10 cas) et les sujets d'ostéomyélite du pied sans diabète (groupe ND) (taille d'échantillon ≥ 10 cas) ont été sélectionnés conformément aux critères d'inclusion. Les chirurgiens ont prélevé des échantillons osseux peropératoires chez les 28 patients qui ont nécessité une intervention chirurgicale (débridement ou amputation) pour la prise en charge de leur ostéomyélite[10]. Éviter les cultures de tissus mous ou de voies sinusales, car elles n'étaient pas suffisamment précises pour prédire les pathogènes osseux [11]. Après débridement chirurgical des tissus infectés ou nécrotiques, nettoyés avec une solution saline stérile, des échantillons d'os profond ont été prélevés à l'aide d'instruments stériles. Nous avons systématiquement obtenu des échantillons osseux adéquats et les avons divisés en trois parties. Un pour la culture microbiologique de routine et les tests de sensibilité aux antibiotiques, un pour l'histopathologie et l'autre pour l'analyse du séquençage de l'ADN. Ce processus d'obtention d'échantillons osseux pourrait réduire les risques de contamination par des bactéries colonisant les tissus de la plaie.

Séquençage à haut débit de l'ARNr 16S Deux échantillons ont été envoyés au laboratoire pour une culture conventionnelle et des tests histopathologiques. Le spécimen osseux restant a été placé dans des tuyaux stériles sans aucun moyen de transport et stocké à 4℃ pendant 24 heures, puis congelé à -80C jusqu'à l'extraction de l'ADN. L'ADN génomique a été extrait à l'aide du kit d'extraction d'ADN (YiRui, ShenZhen, Chine) conformément aux instructions du fabricant. L'ADN extrait a fait l'objet d'un contrôle quantitatif et qualitatif par électrophorèse sur gel d'agarose (JS-power 300, PeiQin, ShangHai, Chine). Ensuite, nous avons amplifié la région variable V3-V4 du gène de l'ARNr 16S pour le séquençage à l'aide d'une amorce de fusion directe et inverse-（341F：5'-CCTAYGGGRBGCASCAG-3' et 806R：5'-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3）(ABI GeneAmp 9700 PCR Instrument). Les produits de PCR ont été amplifiés en supprimant les séquences courtes, les séquences singleton et les lectures bruyantes. La réaction PCR a été réalisée dans un volume total de 60 μl, contenant 6 μl de tampon PCR 10× Ex Tap, 6 μl de mélange de dNTP, 0,6 μl d'albumine de sérum bovin (BSA), 0,3 μl d'étiquette Ex, 1 μl d'ADN, 1,2 μl amorces sens et antisens, et 43,7 μlH 2O. L'amplification par PCR a été conduite dans les conditions suivantes : la dénaturation initiale a été conduite à 94°C pendant 5 min, qui a été suivie de 27 cycles à 94°C pendant 30s, 55°C pendant 30s et 72°C pendant 45s. Une extension finale a été réalisée à 72 °C pendant 10 min à partir de 28 échantillons (dont des patients DFO et SFO) séquencés en deux cycles distincts sur Illumina Miseq. Pour obtenir des lectures propres de haute qualité, les lectures brutes ont été filtrées selon les règles suivantes : (1) supprimer les lectures contenant plus de 10 % de nucléotides inconnus et (2) supprimer les lectures contenant moins de 80 % de bases avec une qualité (valeur Q)> 20. Les lectures filtrées ont ensuite été assemblées en balises en fonction du chevauchement entre les lectures appariées avec plus de 10 pb de chevauchement et moins de 2 % de non-concordance. Le logiciel Mothur (v.1.34.0) a été utilisé pour supprimer les balises redondantes afin d'obtenir des balises uniques. Les étiquettes uniques obtenues ont ensuite été utilisées pour calculer l'abondance. Ensuite, nous avons regroupé les séquences en unités taxonomiques opérationnelles (OTU) à l'aide du Greengene. La taxonomie a été attribuée aux OTU à l'aide de la base de données BLASTto the Greengene à 97 % de similarité pour identifier les micro-organismes au niveau du genre (au niveau de l'espèce si possible). Un arbre phylogénétique a été construit à partir de séquences OTU représentatives alignées à l'aide de figtree. La diversité totale des espèces dans un paysage a été déterminée par deux paramètres différents, la diversité moyenne des espèces dans les sites ou les habitats à une échelle plus locale (diversité alpha) et la différenciation entre ces habitats. (diversité bêta). La diversité alpha comprenait à la fois la diversité et la richesse de la communauté : la richesse de la communauté était représentée par l'estimateur ACE ou l'estimateur Chao1. La diversité bêta était le calcul des différences (distance) entre la structure de la communauté du microbiome et l'appartenance en fonction de l'évolution des espèces. Ce type de distance a été calculé à l'aide d'Unifrac pondéré et peut être exécuté par le diagramme d'analyse des coordonnées principales.

Analyse des métagénomes Des bibliothèques d'ADN de métagénomes à partir d'échantillons ont été construites à l'aide du kit TruSeq Nano DNA (FC-121-4002) conformément aux instructions du fabricant, avec de légères modifications. En bref, l'ADN conformé en longueur (350 pb) a été obtenu par sonication. Les fragments d'ADN ont été réparés aux extrémités et la taille de bibliothèque appropriée a été sélectionnée, puis les échantillons ont été en queue A et ligaturés à des adaptateurs. Les systèmes de séquençage NovaSeq 6000 (Illumina) ont été utilisés pour le séquençage et la validation de la bibliothèque. Les données brutes obtenues par séquençage ont une certaine proportion de données de faible qualité selon les règles suivantes : (1) supprimer les lectures contenant plus de 10 % de nucléotides inconnus et (2) supprimer les lectures contenant moins de 80% des bases avec une qualité (Q-value)>20 . Megahit a été utilisé pour épisser les séquences (données propres) après contrôle de la qualité, et des contigs ont été obtenus. Les contigs ont été filtrés en dessous de 1000 pb. Les séquences de vecteur et d'hôte ont été filtrées par BLASTN, avec un seuil de valeur E de 1e-5. Les lectures restantes ont été cartographiées sur le génome humain par alignement SOAP, et les lectures correspondantes ont été supprimées comme étant des contaminants du génome hôte. Les classifications taxonomiques ont été effectuées sur des contigs et des singletons assemblés à l'aide de BLAST par rapport à la base de données NCBI. Et le meilleur hit BLAST a été utilisé pour référencer le rang taxonomique de chaque séquence. Toutes les analyses ont été effectuées en valeurs R et p ont été corrigées pour les tests multiples avec la méthode du taux de fausses découvertes.