두 종류의 골수염의 차이에 관한 연구

당뇨병성 족부 골수염(Dd 그룹) 피험자(샘플 크기 ≥ 10 사례) 및 당뇨병이 없는 족부 골수염(ND 그룹) 피험자(샘플 크기 ≥ 10 사례)를 포함 기준에 따라 수집했습니다. 외과의는 골수염 관리를 위해 외과적 개입(괴사조직 제거 또는 절단)이 필요한 28명의 환자 모두로부터 수술 중 뼈 표본을 수집했습니다[10]. 연조직 또는 부비동 배양은 뼈 병원체를 예측하는 데 충분히 정확하지 않기 때문에 피했습니다[11]. 감염 또는 괴사 조직의 외과적 괴사 조직 제거 후 멸균 식염수로 세척한 후 멸균 기구를 사용하여 깊은 뼈 표본을 채취했습니다. 우리는 정기적으로 적절한 뼈 표본을 얻어 세 부분으로 나누었습니다. 하나는 일상적인 미생물 배양 및 항생제 감수성 검사용, 하나는 조직병리학용, 다른 하나는 DNA 시퀀싱 분석용입니다. 뼈 표본을 얻기 위한 이 과정은 상처 조직 식민지 박테리아에 의한 오염 가능성을 줄일 수 있습니다.

16S rRNA high-throughput sequencing 기존 배양 및 조직병리학적 검사를 위해 두 개의 표본을 실험실로 보냈습니다. 남은 뼈 표본은 수송 배지 없이 멸균된 파이프에 넣어 4℃에서 24시간 동안 보관한 후 DNA 추출 전까지 -80℃에서 동결시켰다. 제조사의 지침에 따라 DNA 추출 키트(YiRui, ShenZhen, China)를 사용하여 게놈 DNA를 추출하였다. 추출된 DNA는 agarose gel 전기영동(JS-power 300, PeiQin, ShangHai, China)으로 정량 및 품질관리를 하였다. 그런 다음 순방향 및 역방향 융합 프라이머를 사용하여 시퀀싱을 위해 16S rRNA 유전자의 V3-V4 가변 영역을 증폭했습니다. 기구). PCR 산물은 짧은 서열, 싱글톤 서열 및 시끄러운 판독을 제거하여 증폭되었습니다. PCR 반응은 10X Ex Tap PCR 완충액 6 μl, dNTP 혼합물 6 μl, BSA(bovine serum albumin) 0.6 μl, Ex Tag 0.3 μl, DNA 1 μl, 정방향 및 역방향 프라이머, 및 43.7 μlH 2O. PCR 증폭은 다음 조건에서 수행하였다: 초기 변성은 94°C에서 5분 동안 수행한 후, 94°C에서 30초, 55°C에서 30초, 72°C에서 45초 동안 27주기를 수행하였다. 최종 확장은 Illumina Miseq에서 두 번의 개별 실행에 걸쳐 시퀀싱된 28개 샘플(DFO 및 SFO 환자 포함)에서 10분 동안 72°C에서 수행되었습니다. 고품질 클린 읽기를 얻기 위해 다음 규칙에 따라 원시 읽기를 필터링했습니다. 그런 다음 필터링된 읽기는 10bp 이상의 중첩과 2% 미만의 불일치가 있는 페어드 엔드 읽기 사이의 중첩에 따라 태그로 어셈블되었습니다. 고유한 태그를 얻기 위해 소프트웨어 Mothur(v.1.34.0)를 사용하여 중복 태그를 제거했습니다. 그런 다음 얻은 고유 태그를 사용하여 풍부도를 계산했습니다. 그런 다음 Greengene을 사용하여 시퀀스를 운영 분류 단위(OTU)로 클러스터링했습니다. 속 수준(가능한 경우 종 수준)에서 미생물을 식별하기 위해 97% 유사성에서 Greengene 데이터베이스에 대한 BLAST를 사용하여 분류법을 OTU에 할당했습니다. figtree를 사용하여 정렬된 대표적인 OTU 시퀀스로부터 계통 발생 수목을 구축했습니다. 경관의 총 종 다양성은 두 가지 다른 매개변수, 즉 지역적 규모(알파 다양성)에서 사이트 또는 서식지의 평균 종 다양성과 해당 서식지 간의 차별화에 의해 결정되었습니다. (베타 다양성). 알파 다양성에는 커뮤니티 다양성과 풍부함이 모두 포함되었습니다. 커뮤니티 풍부성은 ACE 추정기 또는 Chao1 추정기로 표현되었습니다. 베타 다양성은 종의 진화를 기반으로 미생물 군집 구조와 구성원 사이의 차이(거리)를 계산한 것입니다. 이러한 거리는 Weighted Unifrac을 사용하여 계산되었으며 Principal Coordinates Analysis 다이어그램으로 수행할 수 있습니다.

Metagenomes 분석 TruSeq Nano DNA 키트(FC-121-4002)를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 약간 수정하여 표본의 metagenome DNA 라이브러리를 구성했습니다. 간단히 말해서 길이 일치 DNA(350 bp)는 초음파 처리를 통해 얻었습니다. DNA 조각을 말단 수리하고 적절한 라이브러리 크기를 선택한 다음 샘플을 A-tailed하고 어댑터에 결찰했습니다. NovaSeq 6000 시퀀싱 시스템(Illumina)은 시퀀싱 및 라이브러리 검증에 사용되었습니다. 시퀀싱으로 얻은 원시 데이터에는 다음 규칙에 따라 일정 비율의 저품질 데이터가 있습니다. 품질(Q-값)>20인 염기의 80% 미만. 품질 관리 후 시퀀스(클린 데이터)를 Megahit을 사용하여 스플라이싱하고 콘티그를 얻었습니다. 콘티그는 1000bp 미만으로 필터링되었습니다. 벡터 및 숙주 서열은 1e-5의 E-값 컷오프로 BLASTN에 의해 ​​필터링되었다. 나머지 읽기는 SOAP 정렬에 의해 인간 게놈에 매핑되었고 일치하는 읽기는 호스트 게놈에서 오염 물질로 제거되었습니다. NCBI 데이터베이스에 대해 BLAST를 사용하여 조립된 콘티그 및 싱글톤에 대해 분류학적 분류를 수행했습니다. 그리고 최고의 BLAST 히트는 각 시퀀스의 분류학적 순위를 참조하는 데 사용되었습니다. 모든 분석은 R에서 수행되었으며 p 값은 잘못된 발견률 방법으로 다중 테스트를 위해 수정되었습니다.