Estudiando la diferencia entre dos tipos de osteomielitis

Los sujetos con osteomielitis del pie diabético (grupo Dd) (tamaño de la muestra ≥ 10 casos) y los sujetos con osteomielitis del pie sin diabetes (grupo ND) (tamaño de la muestra ≥ 10 casos) se recolectaron de acuerdo con los criterios de inclusión. Los cirujanos recolectaron muestras óseas intraoperatorias de los 28 pacientes que requirieron una intervención quirúrgica (desbridamiento o amputación) para el tratamiento de su osteomielitis[10]. Se evitaron los cultivos de tejidos blandos o del tracto sinusal, porque no eran lo suficientemente precisos para predecir los patógenos óseos[11]. Después del desbridamiento quirúrgico del tejido infectado o necrótico, limpiado con solución salina estéril, se recogieron muestras de hueso profundo utilizando instrumentos estériles. Rutinariamente obtuvimos muestras de hueso adecuadas y las dividimos en tres partes. Uno para cultivo microbiológico de rutina y pruebas de sensibilidad a antibióticos, uno para histopatología y otro para análisis de secuenciación de ADN. Este proceso para obtener muestras de hueso podría reducir las posibilidades de contaminación por bacterias colonizadoras del tejido de la herida.

Secuenciación de alto rendimiento de 16S rRNA Se enviaron dos muestras al laboratorio para cultivo convencional y pruebas histopatológicas. La muestra de hueso que quedó se colocó en tubos estériles sin ningún medio de transporte y se almacenó a 4 ℃ durante 24 horas y luego se congeló a -80 C hasta la extracción de ADN. El ADN genómico se extrajo utilizando un kit de extracción de ADN (YiRui, ShenZhen, China) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ADN extraído fue control cuantitativo y de calidad mediante electroforesis en gel de agarosa (JS-power 300, PeiQin, ShangHai, China). Luego, amplificamos la región variable V3-V4 del gen 16S rRNA para la secuenciación usando un cebador de fusión directo e inverso (341F: 5'-CCTAYGGGRBGCASCAG-3' y 806R: 5'-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3) (ABI GeneAmp 9700 PCR Instrumento). Los productos de PCR se amplificaron eliminando secuencias cortas, secuencias únicas y lecturas ruidosas. La reacción de PCR se realizó en un volumen total de 60 μl, que contenía 6 μl de tampón de PCR Ex Tap 10x, 6 μl de mezcla de dNTP, 0,6 μl de albúmina de suero bovino (BSA), 0,3 μl de etiqueta Ex, 1 μl de ADN, 1,2 μl cebadores directo e inverso, y 43,7 μlH 2O. La amplificación por PCR se realizó en las siguientes condiciones: la desnaturalización inicial se realizó a 94 °C durante 5 min, seguida de 27 ciclos a 94 °C durante 30 s, 55 °C durante 30 s y 72 °C durante 45 s. Se realizó una extensión final a 72 °C durante 10 min a partir de 28 muestras (incluidos pacientes con DFO y SFO) que se secuenciaron en dos ejecuciones separadas en Illumina Miseq. Para obtener lecturas limpias de alta calidad, las lecturas sin procesar se filtraron de acuerdo con las siguientes reglas: (1) eliminar lecturas que contenían más del 10 % de nucleótidos desconocidos y (2) eliminar lecturas que contenían menos del 80 % de bases con calidad (valor Q) >20. Luego, las lecturas filtradas se ensamblaron en etiquetas de acuerdo con la superposición entre las lecturas de extremos emparejados con más de 10 pb de superposición y menos del 2 % de desajuste. Se utilizó el software Mothur (v.1.34.0) para eliminar las etiquetas redundantes y obtener etiquetas únicas. Las etiquetas únicas obtenidas luego se usaron para calcular la abundancia. Luego agrupamos las secuencias en unidades taxonómicas operativas (OTU) usando Greengene. La taxonomía se asignó a las OTU utilizando BLAST en la base de datos Greengene con una similitud del 97 % para identificar microorganismos a nivel de género (nivel de especie cuando fue posible). Se construyó un árbol filogenético a partir de secuencias OTU representativas alineadas utilizando figtree. La diversidad total de especies en un paisaje se determinó mediante dos parámetros diferentes, la diversidad media de especies en sitios o hábitats a una escala más local (diversidad alfa) y la diferenciación entre esos hábitats. (diversidad beta). La diversidad alfa incluía tanto la diversidad como la riqueza de la comunidad: la riqueza de la comunidad estaba representada por el estimador ACE o el estimador Chao1. La diversidad beta fue el cálculo de las diferencias (distancia) entre la estructura de la comunidad de microbiomas y la membresía en función de la evolución de las especies. Este tipo de distancia se calculó utilizando el Unifrac ponderado y se puede realizar mediante el diagrama de análisis de coordenadas principales.

Análisis de metagenomas Se construyeron bibliotecas de ADN de metagenomas a partir de muestras utilizando el kit de ADN TruSeq Nano (FC-121-4002) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, con ligeras modificaciones. En resumen, el ADN de longitud conformada (350 pb) se obtuvo mediante sonicación. Se repararon los extremos de los fragmentos de ADN y se seleccionó el tamaño de biblioteca apropiado, luego las muestras se colocaron en la cola A y se ligaron a los adaptadores. Los sistemas de secuenciación NovaSeq 6000 (Illumina) se usaron para secuenciar y validar bibliotecas. Los datos sin procesar obtenidos mediante secuenciación tienen una cierta proporción de datos de baja calidad de acuerdo con las siguientes reglas: (1) eliminar lecturas que contengan más del 10 % de nucleótidos desconocidos y (2) eliminar lecturas que contengan menos del 80% de las bases con calidad (valor Q)>20. Se utilizó Megahit para empalmar las secuencias (datos limpios) después del control de calidad y se obtuvieron los contigs. Los contigs se filtraron por debajo de 1000 pb. Las secuencias del vector y del huésped se filtraron mediante BLASTN, con un límite de valor E de 1e-5. Las lecturas restantes se asignaron al genoma humano mediante la alineación SOAP, y las lecturas coincidentes se eliminaron como contaminantes del genoma huésped. Las clasificaciones taxonómicas se realizaron en contigs y singletons ensamblados utilizando BLAST contra la base de datos NCBI. Y se utilizó el mejor acierto de BLAST para referir el rango taxonómico de cada secuencia. Todos los análisis se realizaron en R y los valores de p se corrigieron para múltiples pruebas con el método de tasa de descubrimiento falso.