免疫細胞の細胞ストレスを調節して、症候性ウイルス感染の割合を減らす

募集および募集プロセスの基準：被験者は、SingHealth Investigational Medicine Unit（IMU）の健康なボランティアデータベースおよび募集ポスターから募集されます。 被験者には、参加者情報およびインフォームド コンセント フォームのコピーが渡され、到着時に読むことができます。 研究に関する説明会は、治験責任医師によって実施されます。 その後、被験者はインフォームドコンセントが得られ、研究に関する質問が自由にできる個室に案内されます。 被験者は、研究への参加を急がれることはありません。 彼らは、研究への参加について家族と話すことが奨励されます。そして、家族と話し合うまで参加の決定を（偏見なく）延期することができました。

スクリーニング訪問および手順: 被験者は、SingHealth Investigational Medicine Unit (IMU) を通じて募集されます。 研究に関連する手順または評価が実施される前に、書面によるインフォームド コンセントが取得されます。 研究への募集に対するすべての被験者の適格性は、スクリーニング訪問中に評価する必要があります。 被験者は、セクション3.3およびセクション3.4に概説されているすべての包含基準および除外基準をそれぞれ満たして、研究への登録資格を得る必要があります。 適格基準は、投与前に確認する必要があります。 スクリーニングが予定されているすべての臨床検査は、投与前のベースラインを確立するために収集されます。 研究を開始する前に完了しなければならないその他の手順には、完全な身体検査と尿妊娠検査 (出産の可能性のある女性被験者の場合) が含まれます。

治験来院および手順: すべての適格な被験者は 1 日目に進み、1 日 2 回連続 7 日間 (1 日目から 7 日目) メトホルミン 1000mg またはプラセボのいずれかに 1:1 で無作為に割り付けられます。 4日目に、治験薬の投与前に被験者にYF17Dを1回投与します。 被験者は、1日目（研究前の薬物）、4日目（YF17D前）、5、7、11、14、18日目にSingHealth IMUに報告します（参加者のみが同意します scRNA-seqおよびT細胞研究）および研究採血のための32日目。 採血のスケジュールは、すべての研究グループで同じです。 すべての研究用血液サンプルは、分析前に募集が完了するまで-80℃で保存されます。 被験者の募集と採血は、専用の初期段階の臨床試験施設である SingHealth Investigational Medicine Unit (IMU) で外来患者の研究として実施されます。 これまでの経験から、目標サンプルサイズを満たすために必要な数の参加者を研究に募集するのに問題はないと予想しています.

研究後のフォローアップと手順: 研究後のフォローアップや手順の要件はありません。

安全性監視計画: 研究は、e-CRF、ソース文書、およびその他の研究ファイルへのアクセスを許可されなければならない政府の検査官/規制当局によって評価される場合があります。 査察官は CRF をレビューし、ソース文書と比較して正確かつ完全なデータ収集を検証し、研究がプロトコル、ICH-Good Clinical Practices (ICH-GCP)、および適用されるすべての規制に従って実施されていることを確認します。

メトホルミンの既知の一般的な有害事象には、下痢、吐き気、胃痛、胸やけ、膨満感などがあります。 まれな有害事象には、乳酸アシドーシスおよび低血糖症が含まれます。 メトホルミンの投与期間を 10 日間に制限すると、これらの深刻な AE のリスクがさらに低下します。 被験者は、これらの AE に関連する初期症状に注意し、これらの症状が発生した場合は直ちに IMU に報告するように訓練されます。 AE イベントの用語、イベントの開始と終了の日時、重症度、CTCAE または与えられた治療の使用、作業および研究の継続への影響、およびイベントの最終結果の詳細は、解決まで症例報告に記録されます。イベントの。

研究中、研究者は被験者を募集し、予定された訪問と予定外の訪問の両方で完全な病歴聴取と身体検査を行います。 治験責任医師は、潜在的な副作用について被験者の日記を確認し、発生した場合は最良の臨床実践に基づいて AE を管理します。 治験プロトコルの順守は、薬歴、ピルカウント、日記の検査、および特定の時点でのメトホルミン薬物レベルの測定によってチェックされます。

データ品質保証: PI と Co-Is は、データと安全性の監視のために定期的に調査をレビューします。 内部品質チェックは、研究チームのメンバーである 2 人の CRC によって実施されます。 ある CRC によって入力されたデータは、ソース ドキュメントを使用して別の CRC によってチェックされます。 この研究は、SingHealth Office of Research Integrity and Compliance (ORIC) による監視対象として選ばれたり、e-CRF、ソース文書、その他の研究ファイルへのアクセスを許可されなければならない政府の検査官/規制当局によって評価されたりすることもあります。 モニター/検査官は、CRF をレビューし、それらをソース文書と比較して、正確かつ完全なデータ収集を検証し、研究がプロトコル、ICH-Good Clinical Practices (ICH-GCP)、および適用されるすべての規制に従って実施されていることを確認することができます。

データの入力と保存: すべての参加者のデータは、募集時に匿名化されます。 CRF、ログ、日誌などのハードコピーの研究データ収集フォームは、治験責任医師のサイト ファイルに保管され、SingHealth IMU に施錠されて保管され、委任された治験チーム メンバーのみがアクセスできます。 人口統計データおよび臨床データの直接データ キャプチャは、ソース ドキュメントにキャプチャされます。 識別子は別のオフィスの別のファイルに保管され、参加者のプライバシーを保護するためにあらゆる努力が払われます。 分析されるデータには、匿名化されたデータのみが含まれます。 電子データキャプチャシステムが使用されます。 すべての電子データはパスワードで保護され、研究チームのメンバーのみがアクセスできます。 検体、検査結果、または病原体データは、Duke-NUS EID ラボのスタンドアローン PC に保存され、アクセスはパスワードで保護されます。

サンプルサイズの決定: 腕あたり 20 のサンプルサイズは、プラセボを受けた参加者とプレボ両側 5% のタイプ I エラー率でメトホルミン対プラセボ群で治療 (PASS 13 ソフトウェア)。 潜在的な脱落率 10% を考慮に入れると、合計サンプル サイズは合計 44 (アームあたり 22) になります。 YF ワクチン試験での被験者募集に関する以前の経験から、1 か月の追跡期間中に脱落者はいませんでした。 そのため、試験期間内に必要な数の被験者を募集できると確信しています。

統計分析: フィッシャーの正確確率検定を使用して、プラセボ群とメトホルミン前治療群の間の全身症状率の差を評価します。 AE 率の信頼区間 (CI) は、正確な方法を使用して推定されます。 リスク差の CI は、Newcombe のスコア法を使用して推定されます。

診断プロットは、パラメトリック分析またはノンパラメトリック分析で生データまたは対数変換データを使用する選択を決定するために使用されます。 ２８日目の抗ＹＦ中和抗体力価、ウイルス血症およびＳＢＲＥＰ－１発現の差を、プラセボ群とメトホルミン群との間で比較する。 全身症状、免疫原性の分子相関、ウイルス血症、抗体価、およびメトホルミンの間の関係は、回帰法で調査されます。 全身症状の発症がある被験者とない被験者間の背景特性の違いは、共変量調整分析に含まれます。

治験薬の血中レベルの決定：治験薬のレベルは、液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析（LC-MS/MS）アッセイ法によって測定されます。 アッセイは、シンガポール総合病院で利用可能な Shimadzu 8060 LC-MS/MS システムで実行されます。

遺伝子発現研究: 全血中の遺伝子発現は、Nanostring nCounter アッセイを使用して実行されます。 このアッセイは、適応小胞体ストレスを症候性 YF17D 感染の感受性因子として特定したマイクロアレイからのヒットを検証するために研究者が以前に使用した遺伝子を特定するための多重アプローチを提供します (予備データを参照)。 重要なことに、研究者は Nanostring と協力して、ER ストレスおよび TCA サイクル経路における mRNA 転写物を直接定量化できるプローブの包括的なセットをカスタマイズしました。これは、この試験の標的遺伝子となります。 このアプローチは、CSA 予算の制約のためにも選択されます。 それにもかかわらず、研究チームはバックアップとして追加の臨床サンプルを収集し、他の助成金源からの追加の資金提供を通じてメトホルミンの薬理ゲノミクスを発見するために RNAseq の使用を調査します。

この提案された遺伝子発現研究は、ウイルス研究および実験医学センター @ SingHealth Duke-NUS (ViREMiCS) で実施されます。 ViREMiCS は、SingHealth Duke-NUS Academic Medicine Center パートナーシップの研究センターとして、主任研究者で共同研究者の Eng Eong Ooi によって設立されました。 概念実証の臨床試験をサポートおよび加速するための一連の分子生物学およびシステム生物学ツールを確立しました。 したがって、研究者は、このアプローチを使用して血液サンプル中の遺伝子発現を測定することに問題があるとは予想していません。

プロテオミクスとメタボロミクス プロファイリング: プラズマ メタボロミクスは、キャピラリー電気泳動/質量分析 (CE/MS)、および液体クロマトグラフィー/質量分析 LC-MS/MS を使用して調べます。 、25]。 プロテオミクスは、LC-MS/MS を使用して測定されます。 これらのアッセイは、Duke-NUS の Emerging Infectious Diseases and Metabolomics Core Facility のプログラムで利用可能なコア機器を使用して実行されます。 これにより、強化された生物学的洞察をサポートするマルチオミクス アプローチが可能になります。

ケモカインおよびサイトカイン: 血清ケモカインおよびサイトカインのレベルは、40 を超える血清ケモカインおよびサイトカインを同時に測定できる Luminex または Olink アッセイを使用して測定されます。

YF ウイルス血症および PRNT の力価: YF ウイルス血症負荷は、定量的リアルタイム PCR (qRT-PCR) を使用して評価されます。 抗ＹＦ中和抗体力価は、プラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ）によって測定される。 簡単に説明すると、50 PFU (プラーク形成単位) の YF17D ウイルスを、ヒト血清の 2 倍連続希釈液と共に 37oC で 1 時間インキュベートし、24 ウェル プレートの Vero 細胞の単層に加えます。 1時間後、培地を吸引し、細胞を維持培地中のカルボキシメチルセルロース1%で覆う。 5日後、細胞を固定し、洗浄し、クリスタルバイオレットで染色します。 プラークの数をカウントし、ＰＲＮＴ５０力価を、シグモイド用量反応曲線適合を逆数値として使用して決定する。

scRNA-seq および T 細胞研究: メトホルミン治療の前後に分離された PBMC に対して単一細胞 RNA シーケンス (scRNA-seq) を実行し、さまざまな免疫細胞サブセットに対するメトホルミン治療の影響を判断します。 この提案された研究は、Duke-NUS のゲノム生物学施設と共同で実施されます。 続いて、scRNA-seq の結果をガイドとして使用して、フローサイトメトリーまたは酵素結合免疫吸収スポット (ELISPOT) アッセイのいずれかを使用して、T 細胞の機能と活性を評価します。 これらのアッセイは、Duke-NUS の新興感染症プログラムで利用可能なコア機器を使用して実行されます。