Modulera cellulär stress i immuncellerna för att minska frekvensen av symtomatisk virusinfektion

Kriterier för rekryterings- och rekryteringsprocess: Ämnen kommer att rekryteras från SingHealth Investigational Medicine Unit (IMU) databas med friska volontärer och rekryteringsaffischer. Ämnen kommer att få en kopia av deltagarinformationen och formuläret för informerat samtycke att läsa vid deras ankomst. En informationssession om studien kommer att genomföras av utredaren. Därefter kommer försökspersonerna att ledas in i ett privat rum där informerat samtycke erhålls och där frågor om studien kan ställas fritt. Försökspersoner kommer inte att skynda sig att fatta beslut om att delta i studien. De kommer att uppmuntras att prata med sina familjemedlemmar om deltagande i studien; och får skjuta upp sitt beslut (utan fördomar) att delta till efter diskussion med sina familjemedlemmar.

Screeningbesök och förfaranden: Försökspersoner kommer att rekryteras via SingHealth Investigational Medicine Unit (IMU). Informerat skriftligt medgivande kommer att erhållas innan någon studierelaterad procedur eller bedömning utförs. Alla försökspersoners behörighet för rekrytering till studien ska bedömas vid screeningbesök. Försökspersoner måste uppfylla alla inklusions- och exkluderingskriterier som beskrivs i avsnitt 3.3 respektive avsnitt 3.4 för att vara berättigade till registrering i studien. Behörighetskriterier måste bekräftas före dosering. Alla kliniska laboratorietester som är schemalagda för screening kommer att samlas in för att fastställa baslinjen före dosen. Andra procedurer som måste slutföras innan studien börjar inkluderar en fullständig fysisk undersökning och uringraviditetstest (för kvinnliga försökspersoner i fertil ålder).

Studiebesök och procedurer: Alla kvalificerade försökspersoner kommer att fortsätta till dag 1, där de kommer att randomiseras 1:1 till antingen metformin 1000 mg eller placebo två gånger dagligen under 7 dagar i följd (dagarna 1-7). På dag 4 kommer försökspersonerna att administreras en dos YF17D innan studieläkemedelsdosering. Försökspersoner kommer att rapportera till SingHealth IMU på dag 1 (förstudieläkemedel), dag 4 (pre-YF17D), dag 5, 7, 11, 14, 18 (endast för deltagare som samtycker till scRNA-seq och T-cellsstudier ) och dag 32 för forskningsblodprovtagning. Schemat för blodtagningar kommer att vara identiskt för alla studiegrupper. Alla forskningsblodprover kommer att förvaras vid -80oC tills rekryteringen är klar före analys. Ämnesrekrytering och blodinsamling kommer att genomföras som en öppenvårdsstudie i SingHealth Investigational Medicine Unit (IMU), en dedikerad anläggning för klinisk prövning i tidig fas. Av vår tidigare erfarenhet räknar vi med att vi inte kommer att ha några svårigheter att rekrytera det antal deltagare som krävs till vår studie som är nödvändiga för att nå vår målprovstorlek.

Uppföljning och procedurer efter studien: Det finns inga krav på uppföljning eller procedurer efter studien.

Säkerhetsövervakningsplan: Studien kan utvärderas av statliga inspektörer/tillsynsmyndigheter som måste ges tillgång till e-CRF, källdokument och andra studiefiler. Inspektörerna kommer att granska CRF:er och jämföra dem med källdokument för att verifiera korrekt och fullständig insamling av data och bekräfta att studien genomförs enligt protokollet, ICH-Good Clinical Practices (ICH-GCP) och alla tillämpliga bestämmelser.

Kända vanliga biverkningar av metformin inkluderar diarré, illamående, magsmärtor, halsbränna och uppblåsthet. Sällsynta biverkningar inkluderar laktacidos och hypoglykemi. Att begränsa varaktigheten av metformindoseringen till 10 dagar skulle ytterligare minska risken för dessa allvarliga biverkningar. Försökspersonerna kommer att tränas i att hålla utkik efter tidiga symtom i samband med dessa biverkningar och att omedelbart rapportera till IMU om de upplever något av dessa symtom. Detaljer om terminologi för AE-händelser, datum och tid för händelsens start och slut, svårighetsgrad, användning av CTCAE eller behandling som ges, påverkan på arbetet och fortsättningen av studien, och slutresultatet av händelsen kommer att registreras i fallrapporten tills det löses av händelsen.

Under studien kommer utredaren att rekrytera försökspersonerna, samt utföra fullständig anamnestagning och fysisk undersökning vid både schemalagda och oplanerade besök. Utredaren kommer också att granska försökspersonens dagböcker för eventuella biverkningar och hantera biverkningar baserat på bästa kliniska praxis om de skulle uppstå. Överensstämmelse med studieprotokollet kommer att kontrolleras genom att ta en medicinhistoria, och antalet piller och inspektion av dagboken samt mätning av metforminläkemedelsnivån vid specifika tidpunkter.

Kvalitetssäkring av data: PI och co-Is kommer att granska studien regelbundet för data- och säkerhetsövervakning. Interna kvalitetskontroller kommer att utföras av två CRC som är studiegruppsmedlemmar. Data som skrivs in av en CRC kommer att kontrolleras av en annan med hjälp av källdokumenten. Studien kan också väljas för övervakning av SingHealth Office of Research Integrity and Compliance (ORIC) eller utvärderas av statliga inspektörer/tillsynsmyndigheter som måste tillåtas tillgång till e-CRF, källdokument och andra studiefiler. Övervakarna/inspektörerna kan granska CRF:er och jämföra dem med källdokument för att verifiera korrekt och fullständig insamling av data och bekräfta att studien genomförs enligt protokollet, ICH-Good Clinical Practices (ICH-GCP) och alla tillämpliga bestämmelser.

Datainmatning och lagring: Alla deltagares data kommer att avidentifieras vid rekryteringen. Pappersformulär för insamling av forskningsdata såsom CRF:er, loggar och dagböcker kommer att förvaras i utredarens webbplatsfil och lagras i SingHealth IMU under lås och nyckel, endast tillgängligt för delegerade studieteammedlemmar. Direkt datafångst av demografisk och klinisk data kommer att fångas på källdokument. Identifierare kommer att förvaras i en separat fil på ett annat kontor och alla ansträngningar kommer att göras för att skydda deltagarnas integritet. Data som ska analyseras kommer endast att innehålla avidentifierade data. Ett elektroniskt datainsamlingssystem kommer att användas. All elektronisk data kommer att vara lösenordsskyddad och kan endast nås av studieteammedlemmar. Prover, testresultat eller patogendata kommer att lagras på Duke-NUS EID-laboratorium i en fristående dator där åtkomsten är lösenordsskyddad.

Bestämning av provstorlek: En provstorlek på 20 per arm ger 80 % kraft att upptäcka en minskning av systemiska symtom från 50 % till 10 % (riskskillnad = 0,4 reduktionskvot = 0,8) hos deltagare som får placebo jämfört med som är pre- behandlas med metformin kontra placebogruppen med en 2-sidig 5 % typ I felfrekvens (PASS 13 Software). Om man räknar in en potentiell bortfallsfrekvens på 10 %, är den totala urvalsstorleken totalt 44 (22 per arm). Från vår tidigare erfarenhet av försökspersonersrekrytering i YF-vaccinförsöket förekom inga avhopp under den 1-månaders uppföljningsperioden. Därför är vi övertygade om att vi kan rekrytera det antal försökspersoner som krävs inom försöksperioden.

Statistisk analys: Fishers exakta test kommer att användas för att bedöma skillnaden i systemisk symtomfrekvens mellan placebo och metformin före behandlingsarmen. Konfidensintervall (CI) för AE-frekvenser kommer att uppskattas med den exakta metoden. CI för riskskillnad kommer att uppskattas med hjälp av Newcombes poängmetod.

Diagnostiska diagram kommer att användas för att bestämma valet av att använda rådata eller log-transformerade data i parametriska analyser eller icke-parametriska analyser. Skillnader i anti-YF-neutraliserande antikroppstiter vid dag 28, viremi och SBREP-1-uttryck kommer att jämföras mellan placebo- och metformingrupper. Sambandet mellan systemiska symtom, molekylära korrelat av immunogenicitet, viremi, antikroppstiter och metformin kommer att utforskas med regressionsmetoder. Skillnader i bakgrundsegenskaper mellan försökspersoner som har och inte har systemiska symtomdebut kommer att inkluderas i kovariatjusterad analys.

Bestämning av studieläkemedlets blodnivå: Studieläkemedelsnivåerna kommer att mätas via en vätskekromatografi-tandem masspektrometrisk (LC-MS/MS) analysmetod. Analysen kommer att utföras på ett Shimadzu 8060 LC-MS/MS-system, som finns tillgängligt på Singapore General Hospital.

Genuttrycksstudier: Genuttryck i helblod skulle utföras med Nanostring nCounter-analys. Denna analys ger en multiplexansats för att identifiera generna som utredaren tidigare har använt för att validera träffarna från mikroarrayen som identifierade adaptiv ER-stress som en känslighetsfaktor för symptomatisk YF17D-infektion (se preliminära data). Viktigt är att utredaren har arbetat med Nanostring för att anpassa en omfattande uppsättning sönder som kan direkt kvantifiera mRNA-transkript i ER-stress- och TCA-cykelvägarna, som skulle vara målgenerna i denna studie. Detta tillvägagångssätt är också valt på grund av CSA:s budgetbegränsning. Icke desto mindre kommer studiegruppen att samla in extra kliniska prover som backup och utforska användningen av RNAseq för att upptäcka farmakogenomiken hos metformin genom ytterligare finansiering från andra bidragskällor.

Denna föreslagna genuttrycksstudie kommer att genomföras vid Viral Research and Experimental Medicine Center @ SingHealth Duke-NUS (ViREMiCS). ViREMiCS etablerades av PI och samarbetspartner, Eng Eong Ooi, som ett forskningscenter i partnerskapet SingHealth Duke-NUS Academic Medicine Center. Den har etablerat en svit av molekylära och systembiologiska verktyg för att stödja och påskynda proof-of-concept kliniska prövningar. Utredarna förutser alltså inga problem med att använda detta tillvägagångssätt för att mäta genuttryck i blodprover.

Proteomik och metabolomisk profilering: Plasmametabolomik kommer att undersökas med hjälp av kapillärelektrofores/masspektrometri (CE/MS), och vätskekromatografi/masspektrometri LC-MS/MS som vi tidigare har använt för att mäta de polära metaboliterna från glykolys och TCA-cykel [18 25]. Proteomics kommer att mätas med LC-MS/MS. Dessa analyser kommer att utföras med hjälp av kärnutrustningen som finns tillgänglig i programmet för nya infektionssjukdomar och Metabolomics Core Facility, båda i Duke-NUS. Detta kommer att möjliggöra en multiomics-metod för att stödja förbättrade biologiska insikter.

Kemokin och cytokin: Kemokin- och cytokinnivåer i serum kommer att mätas med hjälp av Luminex- eller Olink-analysen som gör att fler än 40 serumkemokiner och cytokiner kan mätas samtidigt.

YF-viremi- och PRNT-titrar: YF-viremia-belastningar kommer att bedömas med hjälp av kvantitativ realtids-PCR (qRT-PCR). Anti-YF neutraliserande antikroppstitrar kommer att mätas med plackreduktionsneutralisationstest (PRNT). Kortfattat kommer 50 PFU (plackbildande enheter) av YF17D-virus att inkuberas med 2-faldiga serieutspädningar av humant serum i en timme vid 37oC och sedan läggas till ett monolager av Vero-celler i 24-brunnars plattor. En timme senare kommer media att aspireras och celler täckas med karboximetylcellulosa 1% i underhållsmedia. Efter 5 dagar fixeras cellerna, tvättas och färgas med kristallviolett. Antalet plack kommer att räknas och PRNT50-titrar bestäms med hjälp av en sigmoid dos-responskurva som ömsesidiga värden.

scRNA-seq och T-cell Studier: Enkelcells RNA-sekvensering (scRNA-seq) kommer att utföras på PBMCs isolerade före och efter metforminbehandling för att bestämma effekten av metforminbehandling på olika immuncellsundergrupper. Denna föreslagna studie kommer att genomföras i samarbete med Genome Biology Facility vid Duke-NUS. Därefter, med hjälp av resultaten av scRNA-seq som en guide, kommer vi sedan att bedöma T-cellsfunktion och aktivitet med antingen flödescytometri eller enzymkopplad immunabsorberande fläckanalys (ELISPOT). Dessa analyser kommer att utföras med hjälp av kärnutrustning som finns tillgänglig i programmet för nya infektionssjukdomar i Duke-NUS.