Moduler le stress cellulaire dans les cellules immunitaires pour réduire le taux d'infection virale symptomatique

Critères de recrutement et processus de recrutement: Les sujets seront recrutés à partir de la base de données des volontaires sains de l'unité de médecine expérimentale (IMU) SingHealth et des affiches de recrutement. Les sujets recevront une copie du formulaire d'information et de consentement éclairé du participant à lire à leur arrivée. Une séance d'information sur l'étude sera menée par l'enquêteur. Par la suite, les sujets seront introduits dans une salle privée où le consentement éclairé est obtenu et où les questions sur l'étude peuvent être posées librement. Les sujets ne seront pas pressés de prendre la décision de participer à l'étude. Ils seront encouragés à parler aux membres de leur famille de leur participation à l'étude ; et autorisés à différer leur décision (sans aucun préjudice) de participer jusqu'à après discussion avec les membres de leur famille.

Visites et procédures de dépistage : les sujets seront recrutés via l'unité de médecine expérimentale (IMU) de SingHealth. Un consentement écrit éclairé sera obtenu avant toute procédure ou évaluation liée à l'étude. L'éligibilité de tous les sujets au recrutement dans l'étude doit être évaluée lors de la visite de sélection. Les sujets doivent satisfaire à tous les critères d'inclusion et d'exclusion décrits respectivement dans les sections 3.3 et 3.4 pour être éligibles à l'inscription à l'étude. Les critères d'éligibilité doivent être confirmés avant le dosage. Tous les tests de laboratoire clinique programmés pour le dépistage seront collectés pour établir la ligne de base pré-dose. D'autres procédures qui doivent être complétées avant le début de l'étude comprennent un examen physique complet et un test de grossesse urinaire (pour les femmes en âge de procréer).

Visites et procédures d'étude : Tous les sujets éligibles passeront au jour 1, où ils seront randomisés 1:1 pour recevoir soit de la metformine 1000 mg, soit un placebo deux fois par jour pendant 7 jours consécutifs (jours 1 à 7). Le jour 4, les sujets recevront une dose de YF17D avant l'administration du médicament à l'étude. Les sujets se rapporteront à l'IMU SingHealth le jour 1 (médicament pré-étude), le jour 4 (pré-YF17D), les jours 5, 7, 11, 14, 18 (uniquement pour les participants qui consentent aux études de scRNA-seq et de cellules T ) et le jour 32 pour le prélèvement sanguin de recherche. Le calendrier des prises de sang sera identique pour tous les groupes d'étude. Tous les échantillons sanguins de recherche seront conservés à -80 oC jusqu'à ce que le recrutement soit terminé avant l'analyse. Le recrutement des sujets et la collecte de sang seront effectués dans le cadre d'une étude ambulatoire dans l'unité de médecine expérimentale (IMU) de SingHealth, une installation dédiée aux essais cliniques de phase précoce. D'après notre expérience antérieure, nous prévoyons que nous n'aurons pas de difficulté à recruter le nombre requis de participants à notre étude nécessaire pour atteindre la taille de notre échantillon cible.

Suivi et procédures après l'étude : Il n'y a aucune exigence de suivi ou de procédures après l'étude.

Plan de surveillance de la sécurité : l'étude peut être évaluée par des inspecteurs gouvernementaux/autorités de réglementation qui doivent être autorisés à accéder aux e-CRF, aux documents sources et à d'autres fichiers d'étude. Les inspecteurs examineront les CRF et les compareront aux documents sources pour vérifier la collecte exacte et complète des données et confirmer que l'étude est menée conformément au protocole, aux bonnes pratiques cliniques de l'ICH (ICH-GCP) et à toutes les réglementations applicables.

Les événements indésirables courants connus de la metformine comprennent la diarrhée, les nausées, les douleurs à l'estomac, les brûlures d'estomac et les ballonnements. Les EI rares comprennent l'acidose lactique et l'hypoglycémie. Limiter la durée d'administration de la metformine à 10 jours réduirait davantage le risque de ces EI graves. Les sujets seront formés pour rechercher les premiers symptômes associés à ces EI et pour signaler immédiatement à l'IMU s'ils ressentent l'un de ces symptômes. Les détails de la terminologie de l'événement EI, la date et l'heure du début et de la fin de l'événement, la gravité, l'utilisation du CTCAE ou le traitement administré, l'impact sur le travail et la poursuite de l'étude, et le résultat final de l'événement seront enregistrés sur le rapport de cas jusqu'à résolution de l'événement.

Au cours de l'étude, l'investigateur recrutera les sujets, effectuera une anamnèse complète et un examen physique lors de visites programmées et non programmées. L'investigateur examinera également les journaux du sujet pour tout effet secondaire potentiel et gérera les EI en fonction des meilleures pratiques cliniques s'ils surviennent. La conformité au protocole de l'étude sera vérifiée en prenant un historique des médicaments, en comptant les pilules et en inspectant le journal ainsi qu'en mesurant le niveau de médicament de metformine à des moments précis.

Assurance de la qualité des données : Le PI et les Co-I examineront périodiquement l'étude pour la surveillance des données et de la sécurité. Des contrôles de qualité internes seront effectués par deux CRC qui sont membres de l'équipe d'étude. Les données saisies par un CRC seront vérifiées par un autre à partir des documents sources. L'étude peut également être sélectionnée pour être surveillée par le Bureau de l'intégrité et de la conformité de la recherche (ORIC) de SingHealth ou évaluée par des inspecteurs gouvernementaux/autorités de réglementation qui doivent être autorisés à accéder aux e-CRF, aux documents sources et à d'autres fichiers d'étude. Les moniteurs/inspecteurs peuvent examiner les CRF et les comparer aux documents sources pour vérifier l'exactitude et l'intégralité de la collecte des données et confirmer que l'étude est menée conformément au protocole, aux bonnes pratiques cliniques de l'ICH (ICH-GCP) et à toutes les réglementations applicables.

Saisie et stockage des données : toutes les données des participants seront anonymisées lors du recrutement. Les formulaires de collecte de données de recherche sur papier tels que les CRF, les journaux et les journaux seront conservés dans le dossier du site de l'investigateur et stockés dans SingHealth IMU sous clé, accessibles uniquement aux membres délégués de l'équipe d'étude. La saisie directe des données démographiques et cliniques sera saisie sur les documents sources. Les identifiants seront conservés dans un fichier séparé dans un autre bureau et tous les efforts seront faits pour protéger la vie privée des participants. Les données à analyser ne contiendront que des données anonymisées. Un système électronique de saisie des données sera utilisé. Toutes les données électroniques seront protégées par un mot de passe et ne seront accessibles qu'aux membres de l'équipe d'étude. Les échantillons, les résultats des tests ou les données sur les agents pathogènes seront stockés au laboratoire Duke-NUS EID dans un PC autonome dont l'accès est protégé par un mot de passe.

Détermination de la taille de l'échantillon : Une taille d'échantillon de 20 par bras donnera une puissance de 80 % pour détecter une réduction des symptômes systémiques de 50 % à 10 % (différence de risque = 0,4 rapport de réduction = 0,8) chez les participants qui reçoivent un placebo par rapport à ceux qui sont pré- traités par la metformine par rapport au groupe placebo à un taux d'erreur de type I bilatéral de 5 % (logiciel PASS 13). En tenant compte d'un taux d'abandon potentiel de 10 %, la taille totale de l'échantillon est de 44 au total (22 par bras). D'après notre expérience précédente avec le recrutement de sujets dans l'essai du vaccin contre la fièvre jaune, il n'y a eu aucun abandon pendant la période de suivi d'un mois. Par conséquent, nous sommes convaincus que nous pouvons recruter le nombre requis de sujets au cours de la période d'essai.

Analyse statistique : le test exact de Fisher sera utilisé pour évaluer la différence de taux de symptômes systémiques entre le groupe placebo et le groupe de prétraitement à la metformine. Les intervalles de confiance (IC) pour les taux d'EI seront estimés à l'aide de la méthode exacte. L'IC pour la différence de risque sera estimé à l'aide de la méthode du score de Newcombe.

Des diagrammes de diagnostic seront utilisés pour déterminer le choix d'utiliser les données brutes ou les données transformées en log dans des analyses paramétriques ou des analyses non paramétriques. Les différences de titre d'anticorps neutralisants anti-YF au jour 28, de virémie et d'expression de SBREP-1 seront comparées entre les groupes placebo et metformine. La relation entre les symptômes systémiques, les corrélats moléculaires de l'immunogénicité, la virémie, le titre d'anticorps et la metformine sera explorée avec des méthodes de régression. Les différences dans les caractéristiques de base entre les sujets qui ont et n'ont pas l'apparition de symptômes systémiques seront incluses dans l'analyse ajustée aux covariables.

Détermination du taux sanguin du médicament à l'étude : les taux de médicament à l'étude seront mesurés par une méthode de dosage par chromatographie liquide et spectrométrie de masse en tandem (LC-MS/MS). Le test sera effectué sur un système Shimadzu 8060 LC-MS/MS, disponible à l'hôpital général de Singapour.

Études d'expression génique : L'expression génique dans le sang total serait réalisée à l'aide du test Nanostring nCounter. Ce test fournit une approche multiplex pour identifier les gènes que l'investigateur a précédemment utilisés pour valider les résultats du microréseau qui ont identifié le stress adaptatif du RE comme facteur de susceptibilité à l'infection symptomatique par YF17D (voir les données préliminaires). Il est important de noter que l'investigateur a travaillé avec Nanostring pour personnaliser un ensemble complet de sondes capables de quantifier directement les transcrits d'ARNm dans les voies du cycle de stress ER et TCA, qui seraient les gènes cibles de cet essai. Cette approche est également choisie en raison de la contrainte budgétaire de l'ASC. Néanmoins, l'équipe de l'étude collectera des échantillons cliniques supplémentaires en tant que sauvegarde et explorera l'utilisation de RNAseq pour découvrir la pharmacogénomique de la metformine grâce à un financement supplémentaire provenant d'autres sources de subventions.

Cette étude d'expression génique proposée sera réalisée au Viral Research and Experimental Medicine Center @ SingHealth Duke-NUS (ViREMiCS). ViREMiCS a été créé par le PI et son collaborateur, Eng Eong Ooi, en tant que centre de recherche dans le cadre du partenariat SingHealth Duke-NUS Academic Medicine Center. Il a mis en place une suite d'outils de biologie moléculaire et systémique pour soutenir et accélérer les essais cliniques de preuve de concept. Les chercheurs n'anticipent donc aucun problème dans l'utilisation de cette approche pour mesurer l'expression des gènes dans des échantillons de sang.

Profilage protéomique et métabolomique : la métabolomique plasmatique sera examinée à l'aide de l'électrophorèse capillaire/spectrométrie de masse (CE/MS) et de la chromatographie liquide/spectrométrie de masse LC-MS/MS, comme nous l'avons précédemment utilisé pour mesurer les métabolites polaires de la glycolyse et du cycle TCA [18 , 25]. La protéomique sera mesurée par LC-MS/MS. Ces tests seront effectués à l'aide de l'équipement de base disponible dans le Programme sur les maladies infectieuses émergentes et l'installation centrale de métabolomique, tous deux à Duke-NUS. Cela permettra une approche multi-omique pour soutenir des connaissances biologiques améliorées.

Chimiokines et cytokines : les taux sériques de chimiokines et de cytokines seront mesurés à l'aide du test Luminex ou Olink qui permet de mesurer simultanément plus de 40 chimiokines et cytokines sériques.

Virémie jaune et titres PRNT : les charges de virémie jaune seront évaluées à l'aide d'une PCR quantitative en temps réel (qRT-PCR). Les titres d'anticorps neutralisants anti-FJ seront mesurés par le test de neutralisation par réduction de plaque (PRNT). En bref, 50 PFU (unités formant des plaques) de virus YF17D seront incubées avec des dilutions en série de 2 fois de sérum humain pendant une heure à 37oC, puis ajoutées à une monocouche de cellules Vero dans des plaques à 24 puits. Une heure plus tard, les médias seront aspirés et les cellules recouvertes de carboxyméthylcellulose 1 % dans les médias d'entretien. Après 5 jours, les cellules seront fixées, lavées et colorées au cristal violet. Le nombre de plaques sera compté et les titres PRNT50 déterminés à l'aide d'un ajustement de courbe dose-réponse sigmoïde comme valeurs réciproques.

ScRNA-seq et études sur les lymphocytes T : le séquençage d'ARN à cellule unique (scRNA-seq) sera effectué sur des PBMC isolés avant et après le traitement par la metformine afin de déterminer l'impact du traitement par la metformine sur différents sous-ensembles de cellules immunitaires. Cette étude proposée sera réalisée en collaboration avec la Genome Biology Facility de Duke-NUS. Par la suite, en utilisant les résultats de scRNA-seq comme guide, nous évaluerons ensuite la fonction et l'activité des lymphocytes T à l'aide de la cytométrie en flux ou du test ELISPOT (immuno-absorbant lié à une enzyme). Ces tests seront effectués à l'aide de l'équipement de base disponible dans le programme sur les maladies infectieuses émergentes à Duke-NUS.