Modulieren Sie den zellulären Stress in den Immunzellen, um die Rate symptomatischer Virusinfektionen zu reduzieren

Rekrutierungskriterien und Rekrutierungsprozess: Die Probanden werden aus der Datenbank für gesunde Freiwillige und Rekrutierungspostern der SingHealth Investigational Medicine Unit (IMU) rekrutiert. Die Probanden erhalten eine Kopie der Teilnehmerinformationen und der Einverständniserklärung, die sie bei ihrer Ankunft lesen können. Eine Informationssitzung über die Studie wird vom Ermittler durchgeführt. Danach werden die Probanden in einen privaten Raum geführt, wo die Einverständniserklärung eingeholt wird und wo Fragen zur Studie frei gestellt werden können. Die Probanden werden nicht dazu gedrängt, eine Entscheidung zur Teilnahme an der Studie zu treffen. Sie werden ermutigt, mit ihren Familienmitgliedern über die Teilnahme an der Studie zu sprechen; und durften ihre Entscheidung (ohne Vorurteil) zur Teilnahme bis nach Rücksprache mit ihren Familienmitgliedern aufschieben.

Screening-Besuche und -Verfahren: Die Probanden werden über die SingHealth Investigational Medicine Unit (IMU) rekrutiert. Vor der Durchführung eines studienbezogenen Verfahrens oder einer Bewertung wird eine schriftliche Zustimmung nach Aufklärung eingeholt. Die Eignung aller Probanden für die Rekrutierung in die Studie muss während des Screening-Besuchs beurteilt werden. Die Probanden müssen alle in Abschnitt 3.3 bzw. Abschnitt 3.4 beschriebenen Einschluss- und Ausschlusskriterien erfüllen, um für die Aufnahme in die Studie infrage zu kommen. Eignungskriterien müssen vor der Dosierung bestätigt werden. Alle für das Screening geplanten klinischen Labortests werden gesammelt, um den Ausgangswert vor der Dosis zu ermitteln. Andere Verfahren, die vor Beginn der Studie abgeschlossen sein müssen, umfassen eine vollständige körperliche Untersuchung und einen Harnschwangerschaftstest (für weibliche Probanden im gebärfähigen Alter).

Studienbesuche und Verfahren: Alle in Frage kommenden Probanden werden mit Tag 1 fortfahren, wo sie 1:1 randomisiert entweder Metformin 1000 mg oder Placebo zweimal täglich an 7 aufeinanderfolgenden Tagen (Tage 1-7) zugeteilt werden. An Tag 4 wird den Probanden vor der Dosierung des Studienmedikaments eine Dosis YF17D verabreicht. Die Probanden melden sich an Tag 1 (Medikament vor der Studie), Tag 4 (vor YF17D), Tag 5, 7, 11, 14, 18 (nur für Teilnehmer, die scRNA-seq- und T-Zell-Studien zustimmen) bei der SingHealth IMU ) und Tag 32 für Forschungsblutentnahmen. Der Zeitplan für die Blutentnahmen ist für alle Studiengruppen identisch. Alle Forschungsblutproben werden bei -80 °C gelagert, bis die Rekrutierung vor der Analyse abgeschlossen ist. Die Rekrutierung der Probanden und die Blutentnahme werden als ambulante Studie in der SingHealth Investigational Medicine Unit (IMU), einer speziellen Einrichtung für klinische Studien in der Frühphase, durchgeführt. Aufgrund unserer bisherigen Erfahrung gehen wir davon aus, dass wir keine Schwierigkeiten haben werden, die erforderliche Anzahl von Teilnehmern für unsere Studie zu rekrutieren, die erforderlich ist, um unsere angestrebte Stichprobengröße zu erreichen.

Follow-up und Verfahren nach der Studie: Es gibt keine Anforderungen für Follow-up oder Verfahren nach der Studie.

Sicherheitsüberwachungsplan: Die Studie kann von Regierungsinspektoren/Regulierungsbehörden bewertet werden, denen Zugang zu e-CRFs, Quelldokumenten und anderen Studiendateien gewährt werden muss. Die Inspektoren prüfen CRFs und vergleichen sie mit Quelldokumenten, um die genaue und vollständige Erfassung der Daten zu überprüfen und zu bestätigen, dass die Studie gemäß dem Protokoll, ICH-Good Clinical Practices (ICH-GCP) und allen geltenden Vorschriften durchgeführt wird.

Bekannte häufige Nebenwirkungen von Metformin sind Durchfall, Übelkeit, Magenschmerzen, Sodbrennen und Völlegefühl. Seltene UEs sind Laktatazidose und Hypoglykämie. Eine Begrenzung der Dauer der Metformin-Gabe auf 10 Tage würde das Risiko dieser schwerwiegenden UE weiter verringern. Die Probanden werden darin geschult, auf frühe Symptome im Zusammenhang mit diesen UEs zu achten und sich sofort an die IMU zu wenden, wenn sie eines dieser Symptome bemerken. Einzelheiten zur UE-Ereignisterminologie, Datum und Uhrzeit des Ereignisbeginns und -endes, Schweregrad, Verwendung des CTCAE oder der verabreichten Behandlung, Auswirkungen auf die Arbeit und die Fortsetzung der Studie sowie das endgültige Ergebnis des Ereignisses werden bis zur Lösung im Fallbericht festgehalten der Veranstaltung.

Während der Studie rekrutiert der Prüfarzt die Probanden und führt sowohl bei geplanten als auch bei außerplanmäßigen Besuchen eine vollständige Anamneseerhebung und körperliche Untersuchung durch. Der Prüfarzt überprüft auch die Tagebücher des Probanden auf mögliche Nebenwirkungen und behandelt die UEs auf der Grundlage der besten klinischen Praxis, falls sie auftreten. Die Einhaltung des Studienprotokolls wird durch Anamneseerhebung, Pillenzählung und Überprüfung des Tagebuchs sowie Messung des Metformin-Medikamentenspiegels zu bestimmten Zeitpunkten überprüft.

Datenqualitätssicherung: Der PI und Co-Is werden die Studie regelmäßig auf Daten- und Sicherheitsüberwachung überprüfen. Interne Qualitätsprüfungen werden von zwei CRCs durchgeführt, die Mitglieder des Studienteams sind. Die von einem CRC eingegebenen Daten werden von einem anderen anhand der Quelldokumente überprüft. Die Studie kann auch zur Überwachung durch das SingHealth Office of Research Integrity and Compliance (ORIC) ausgewählt oder von staatlichen Inspektoren/Regulierungsbehörden bewertet werden, denen Zugang zu e-CRFs, Quelldokumenten und anderen Studiendateien gewährt werden muss. Die Monitore/Inspektoren können CRFs überprüfen und mit Quelldokumenten vergleichen, um die genaue und vollständige Datenerfassung zu überprüfen und zu bestätigen, dass die Studie gemäß dem Protokoll, ICH-Good Clinical Practices (ICH-GCP) und allen geltenden Vorschriften durchgeführt wird.

Dateneingabe und -speicherung: Alle Daten der Teilnehmer werden bei der Rekrutierung anonymisiert. Gedruckte Formulare zur Erhebung von Forschungsdaten wie CRFs, Protokolle und Tagebücher werden in der Investigator's Site File aufbewahrt und in SingHealth IMU unter Verschluss aufbewahrt und sind nur für delegierte Mitglieder des Studienteams zugänglich. Die direkte Datenerfassung von demografischen und klinischen Daten wird in Quelldokumenten erfasst. Identifikatoren werden in einer separaten Datei in einem anderen Büro aufbewahrt und es werden alle Anstrengungen unternommen, um die Privatsphäre der Teilnehmer zu schützen. Die zu analysierenden Daten enthalten nur anonymisierte Daten. Es wird ein elektronisches Datenerfassungssystem verwendet. Alle elektronischen Daten werden passwortgeschützt und sind nur für Mitglieder des Studienteams zugänglich. Proben, Testergebnisse oder Krankheitserregerdaten werden im EID-Labor von Duke-NUS auf einem eigenständigen PC gespeichert, wobei der Zugriff passwortgeschützt ist.

Bestimmung der Stichprobengröße: Eine Stichprobengröße von 20 pro Arm ergibt eine Aussagekraft von 80 %, um eine Verringerung der systemischen Symptome von 50 % auf 10 % (Risikodifferenz = 0,4, Reduktionsverhältnis = 0,8) bei Teilnehmern, die ein Placebo erhalten, im Vergleich zu denen, die vor behandelt mit Metformin versus Placebo-Gruppe bei einer 2-seitigen Fehlerrate vom Typ I von 5 % (PASS 13 Software). Unter Berücksichtigung einer potenziellen Dropout-Rate von 10 % beträgt die Gesamtstichprobengröße insgesamt 44 (22 pro Arm). Nach unseren bisherigen Erfahrungen mit der Rekrutierung von Probanden in der YF-Impfstoffstudie gab es während des 1-monatigen Nachbeobachtungszeitraums keine Abbrüche. Daher sind wir zuversichtlich, dass wir die erforderliche Anzahl von Probanden innerhalb der Testphase rekrutieren können.

Statistische Analyse: Der exakte Fisher-Test wird verwendet, um den Unterschied in der systemischen Symptomrate zwischen dem Placebo- und dem Metformin-Vorbehandlungsarm zu beurteilen. Konfidenzintervalle (KI) für AE-Raten werden unter Verwendung der exakten Methode geschätzt. Das KI für die Risikodifferenz wird mit der Score-Methode von Newcombe geschätzt.

Diagnostische Diagramme werden verwendet, um die Wahl der Verwendung der Rohdaten oder logarithmisch transformierten Daten in parametrischen Analysen oder nicht-parametrischen Analysen zu bestimmen. Die Unterschiede im Titer der neutralisierenden Anti-YF-Antikörper an Tag 28, der Virämie und der SBREP-1-Expression werden zwischen den Placebo- und Metformingruppen verglichen. Zusammenhänge zwischen systemischen Symptomen, molekularen Korrelaten von Immunogenität, Virämie, Antikörpertiter und Metformin werden mit Regressionsmethoden untersucht. Unterschiede in den Hintergrundmerkmalen zwischen Probanden mit und ohne systemischen Symptombeginn werden in die Kovariaten-angepasste Analyse einbezogen.

Bestimmung des Blutspiegels des Studienarzneimittels: Die Studienarzneimittelspiegel werden über eine Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS)-Assay-Methode gemessen. Der Assay wird auf einem Shimadzu 8060 LC-MS/MS-System durchgeführt, das im Singapore General Hospital verfügbar ist.

Genexpressionsstudien: Die Genexpression in Vollblut würde unter Verwendung des Nanostring nCounter-Assays durchgeführt. Dieser Assay bietet einen Multiplex-Ansatz zur Identifizierung der Gene, die der Forscher zuvor verwendet hat, um die Treffer aus dem Microarray zu validieren, die adaptiven ER-Stress als Anfälligkeitsfaktor für eine symptomatische YF17D-Infektion identifizierten (siehe vorläufige Daten). Wichtig ist, dass die Forscher mit Nanostring zusammengearbeitet haben, um einen umfassenden Satz von Sonden anzupassen, die in der Lage sind, mRNA-Transkripte in den Signalwegen des ER-Stress- und TCA-Zyklus direkt zu quantifizieren, die die Zielgene in dieser Studie wären. Dieser Ansatz wird auch aufgrund der CSA-Budgetbeschränkung gewählt. Nichtsdestotrotz wird das Studienteam zusätzliche klinische Proben als Backup sammeln und die Verwendung von RNAseq untersuchen, um die Pharmakogenomik von Metformin durch zusätzliche Mittel aus anderen Förderquellen zu entdecken.

Diese vorgeschlagene Genexpressionsstudie wird am Viral Research and Experimental Medicine Center @ SingHealth Duke-NUS (ViREMiCS) durchgeführt. ViREMiCS wurde vom PI und Mitarbeiter Eng Eong Ooi als Forschungszentrum in der Partnerschaft SingHealth Duke-NUS Academic Medicine Center gegründet. Es hat eine Reihe von molekular- und systembiologischen Tools entwickelt, um klinische Studien zum Nachweis des Konzepts zu unterstützen und zu beschleunigen. Die Forscher erwarten daher kein Problem bei der Verwendung dieses Ansatzes zur Messung der Genexpression in Blutproben.

Proteomik und metabolomische Profilerstellung: Die Plasma-Metabolomik wird mittels Kapillarelektrophorese/Massenspektrometrie (CE/MS) und Flüssigkeitschromatographie/Massenspektrometrie LC-MS/MS untersucht, wie wir sie zuvor zur Messung der polaren Metaboliten aus der Glykolyse und dem TCA-Zyklus eingesetzt haben [18 , 25]. Die Proteomik wird mit LC-MS/MS gemessen. Diese Assays werden unter Verwendung der Kernausrüstung durchgeführt, die in der Core Facility Program in Emerging Infectious Diseases and Metabolomics, beide in Duke-NUS, verfügbar ist. Dies wird einen Multi-Omics-Ansatz ermöglichen, um verbesserte biologische Erkenntnisse zu unterstützen.

Chemokine und Zytokine: Serum-Chemokine und -Zytokine werden mit dem Luminex- oder Olink-Assay gemessen, der die gleichzeitige Messung von mehr als 40 Serum-Chemokinen und -Zytokinen ermöglicht.

YF-Virämie- und PRNT-Titer: YF-Virämielasten werden mittels quantitativer Echtzeit-PCR (qRT-PCR) bewertet. Anti-YF-neutralisierende Antikörpertiter werden durch Plaque-Reduktions-Neutralisationstest (PRNT) gemessen. Kurz gesagt, 50 PFU (Plaque-bildende Einheiten) des YF17D-Virus werden mit 2-fachen Reihenverdünnungen von Humanserum eine Stunde lang bei 37 °C inkubiert und dann zu einer Monoschicht von Vero-Zellen in Platten mit 24 Vertiefungen gegeben. Eine Stunde später werden die Medien abgesaugt und die Zellen mit 1 % Carboxymethylcellulose in Erhaltungsmedien überschichtet. Nach 5 Tagen werden die Zellen fixiert, gewaschen und mit Kristallviolett gefärbt. Die Anzahl der Plaques wird gezählt und die PRNT50-Titer werden unter Verwendung einer sigmoiden Dosis-Wirkungs-Kurve bestimmt, die als reziproke Werte angepasst ist.

scRNA-seq- und T-Zell-Studien: Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) wird an PBMCs durchgeführt, die vor und nach der Metformin-Behandlung isoliert wurden, um die Auswirkungen der Metformin-Behandlung auf verschiedene Untergruppen von Immunzellen zu bestimmen. Diese vorgeschlagene Studie wird in Zusammenarbeit mit der Genome Biology Facility der Duke-NUS durchgeführt. Anschließend werden wir anhand der Ergebnisse von scRNA-seq als Richtlinie die T-Zell-Funktion und -Aktivität entweder mit Durchflusszytometrie oder mit dem Enzyme-Linked Immune Absorbent Spot (ELISPOT)-Assay bewerten. Diese Assays werden mit Kernausrüstung durchgeführt, die im Rahmen des Programms für neu auftretende Infektionskrankheiten in Duke-NUS verfügbar ist.