Modular o estresse celular nas células imunes para reduzir a taxa de infecção viral sintomática

Critérios para Recrutamento e Processo de Recrutamento: Os participantes serão recrutados a partir do banco de dados de voluntários saudáveis ​​da Unidade de Medicina Investigativa (IMU) da SingHealth e de cartazes de recrutamento. Os participantes receberão uma cópia das Informações do Participante e do Formulário de Consentimento Livre e Esclarecido para ler na chegada. Uma sessão informativa sobre o estudo será conduzida pelo Investigador. Posteriormente, os participantes serão conduzidos a uma sala privada onde o consentimento informado é obtido e onde perguntas sobre o estudo podem ser feitas livremente. Os participantes não serão apressados ​​em tomar a decisão de participar do estudo. Eles serão encorajados a falar com seus familiares sobre a participação no estudo; e autorizados a adiar sua decisão (sem qualquer prejuízo) de participar até depois da discussão com seus familiares.

Visitas de triagem e procedimentos: Os indivíduos serão recrutados por meio da Unidade de Medicina Investigacional (IMU) SingHealth. O consentimento informado por escrito será obtido antes que qualquer procedimento ou avaliação relacionada ao estudo seja realizado. A elegibilidade de todos os indivíduos para recrutamento no estudo deve ser avaliada durante a visita de triagem. Os indivíduos devem satisfazer todos os critérios de inclusão e exclusão descritos na Seção 3.3 e na Seção 3.4, respectivamente, para serem elegíveis para inscrição no estudo. Os critérios de elegibilidade devem ser confirmados antes da dosagem. Todos os testes laboratoriais clínicos agendados para triagem serão coletados para estabelecer a linha de base pré-dose. Outros procedimentos que devem ser concluídos antes do início do estudo incluem um exame físico completo e teste urinário de gravidez (para mulheres com potencial para engravidar).

Visitas e Procedimentos do Estudo: Todos os indivíduos elegíveis prosseguirão para o Dia 1, onde serão randomizados 1:1 para metformina 1000 mg ou placebo duas vezes ao dia por 7 dias consecutivos (Dias 1-7). No dia 4, os indivíduos receberão uma dose de YF17D antes da dosagem do medicamento do estudo. Os participantes se reportarão à IMU SingHealth no Dia 1 (medicamento pré-estudo), Dia 4 (pré-YF17D), Dias 5, 7, 11, 14, 18 (somente para participantes que consentem com scRNA-seq e estudos de células T ) e Dia 32 para amostragem de sangue para pesquisa. A programação das coletas de sangue será idêntica para todos os grupos de estudo. Todas as amostras de sangue de pesquisa serão armazenadas a -80oC até que o recrutamento seja concluído antes da análise. O recrutamento de sujeitos e a coleta de sangue serão conduzidos como um estudo ambulatorial na Unidade de Medicina Investigacional (IMU) SingHealth, uma instalação dedicada a ensaios clínicos em fase inicial. Com base em nossa experiência anterior, prevemos que não teremos dificuldade em recrutar o número necessário de participantes em nosso estudo necessário para atender ao tamanho da amostra alvo.

Acompanhamento e procedimentos pós-estudo: Não há exigência de acompanhamento ou procedimentos pós-estudo.

Plano de Monitoramento de Segurança: O estudo pode ser avaliado por inspetores governamentais/autoridades reguladoras que devem ter acesso a e-CRFs, documentos de origem e outros arquivos de estudo. Os inspetores revisarão os CRFs e os compararão com os documentos de origem para verificar a coleta de dados precisa e completa e confirmar que o estudo está sendo conduzido de acordo com o protocolo, ICH-Boas Práticas Clínicas (ICH-GCP) e todos os regulamentos aplicáveis.

Os eventos adversos comuns conhecidos da metformina incluem diarreia, náusea, dor de estômago, azia e inchaço. EAs raros incluem acidose láctica e hipoglicemia. Limitar a duração da dosagem de metformina a 10 dias reduziria ainda mais o risco desses EAs graves. Os indivíduos serão treinados para procurar sintomas precoces associados a esses EAs e relatar à IMU imediatamente caso apresentem algum desses sintomas. Detalhes da terminologia do evento de EA, data e hora do início e término do evento, gravidade, uso do CTCAE ou tratamento dado, impacto no trabalho e na continuação do estudo e resultado final do evento serão registrados no relatório do caso até a resolução do evento.

Durante o estudo, o investigador irá recrutar os sujeitos, bem como realizar a anamnese completa e exame físico em visitas agendadas e não agendadas. O investigador também revisará os diários do sujeito quanto a possíveis efeitos colaterais e administrará os EAs com base nas melhores práticas clínicas, caso surjam. A conformidade com o protocolo do estudo será verificada por meio de um histórico de medicação, contagem de comprimidos e inspeção do diário, bem como medição do nível da droga metformina em pontos de tempo específicos.

Garantia de qualidade de dados: O PI e Co-Is revisarão o estudo periodicamente para monitoramento de dados e segurança. As verificações internas de qualidade serão realizadas por dois CRCs que são membros da equipe de estudo. Os dados inseridos por um CRC serão verificados por outro usando os documentos de origem. O estudo também pode ser escolhido para monitoramento pelo SingHealth Office of Research Integrity and Compliance (ORIC) ou avaliado por inspetores governamentais/autoridades reguladoras que devem ter acesso a e-CRFs, documentos de origem e outros arquivos de estudo. Os monitores/inspetores podem revisar os CRFs e compará-los com documentos de origem para verificar a coleta de dados precisa e completa e confirmar que o estudo está sendo conduzido de acordo com o protocolo, ICH-Boas Práticas Clínicas (ICH-GCP) e todos os regulamentos aplicáveis.

Entrada e armazenamento de dados: Todos os dados dos participantes serão desidentificados no momento do recrutamento. Formulários impressos de coleta de dados de pesquisa, como CRFs, logs e diários, serão mantidos no Arquivo do Local do Investigador e armazenados na IMU SingHealth sob sete chaves, acessíveis apenas aos membros delegados da equipe de estudo. A captura direta de dados demográficos e clínicos será capturada em documentos de origem. Os identificadores serão mantidos em um arquivo separado em outro escritório e todos os esforços serão feitos para proteger a privacidade dos participantes. Os dados a serem analisados ​​conterão apenas dados não identificados. Será utilizado um sistema eletrônico de captura de dados. Todos os dados eletrônicos serão protegidos por senha e só podem ser acessados ​​por membros da equipe de estudo. Amostras, resultados de testes ou dados de patógenos serão armazenados no laboratório Duke-NUS EID em um PC autônomo pelo qual o acesso é protegido por senha.

Determinação do Tamanho da Amostra: Um tamanho de amostra de 20 por braço dará 80% de poder para detectar uma redução nos sintomas sistêmicos de 50% para 10% (diferença de risco = 0,4 taxa de redução = 0,8) em participantes que receberam placebo versus que são pré- tratados com metformina versus grupo placebo em uma taxa de erro tipo I bilateral de 5% (Software PASS 13). Considerando uma taxa de abandono potencial de 10%, o tamanho total da amostra é de 44 no total (22 por braço). De nossa experiência anterior com o recrutamento de indivíduos no ensaio da vacina contra FA, não houve desistências durante o período de acompanhamento de 1 mês. Portanto, estamos confiantes de que podemos recrutar o número necessário de indivíduos dentro do período experimental.

Análise estatística: O teste exato de Fisher será usado para avaliar a diferença na taxa de sintomas sistêmicos entre o placebo e o braço de pré-tratamento com metformina. Os intervalos de confiança (IC) para as taxas de EA serão estimados pelo método exato. O IC para diferença de risco será estimado usando o método de escore de Newcombe.

Os gráficos de diagnóstico serão usados ​​para determinar a escolha de usar os dados brutos ou dados transformados em log em análises paramétricas ou análises não paramétricas. Diferenças no título de anticorpo neutralizante anti-YF no dia 28, viremia e expressão de SBREP-1 serão comparadas entre os grupos placebo e metformina. A relação entre sintomas sistêmicos, correlatos moleculares de imunogenicidade, viremia, título de anticorpos e metformina será explorada com métodos de regressão. As diferenças nas características de base entre os indivíduos que têm e não têm início de sintomas sistêmicos serão incluídas na análise ajustada por covariáveis.

Determinação do nível sanguíneo do fármaco do estudo: Os níveis do fármaco do estudo serão medidos através de um método de ensaio de espectrometria de massa tandem-cromatografia líquida (LC-MS/MS). O ensaio será realizado em um sistema Shimadzu 8060 LC-MS/MS, que está disponível no Singapore General Hospital.

Estudos de expressão gênica: A expressão gênica em sangue total seria realizada usando o ensaio Nanostring nCounter. Este ensaio fornece uma abordagem multiplex para identificar os genes que o investigador usou anteriormente para validar os acertos do microarray que identificou o estresse adaptativo do RE como um fator de suscetibilidade para infecção sintomática por YF17D (consulte os dados preliminares). É importante ressaltar que o investigador trabalhou com o Nanostring para personalizar um conjunto abrangente de sondas capazes de quantificar diretamente os transcritos de mRNA nas vias do estresse do RE e do ciclo do TCA, que seriam os genes-alvo neste estudo. Essa abordagem também é escolhida devido à restrição orçamentária do CSA. No entanto, a equipe de estudo coletará amostras clínicas extras como backup e explorará o uso de RNAseq para descobrir a farmacogenômica da metformina por meio de financiamento adicional de outras fontes de subsídios.

Este estudo de expressão gênica proposto será realizado no Centro de Pesquisa Viral e Medicina Experimental @ SingHealth Duke-NUS (ViREMiCS). ViREMiCS foi estabelecido pelo PI e colaborador, Eng Eong Ooi como um centro de pesquisa na parceria SingHealth Duke-NUS Academic Medicine Center. Ela estabeleceu um conjunto de ferramentas de biologia molecular e de sistemas para apoiar e acelerar ensaios clínicos de prova de conceito. Os investigadores, portanto, não antecipam nenhum problema no uso dessa abordagem para medir a expressão gênica em amostras de sangue.

Perfil proteômico e metabolômico: A metabolômica plasmática será examinada usando eletroforese capilar/espectrometria de massa (CE/MS) e cromatografia líquida/espectrometria de massa LC-MS/MS, como já empregamos anteriormente para medir os metabólitos polares da glicólise e do ciclo do TCA [18 , 25]. A proteômica será medida usando LC-MS/MS. Esses ensaios serão realizados usando o equipamento principal disponível no Programa de Doenças Infecciosas Emergentes e Central de Metabolômica, ambos em Duke-NUS. Isso permitirá uma abordagem multi-ômica para dar suporte a insights biológicos aprimorados.

Quimiocina e citocina: Os níveis séricos de quimiocina e citocina serão medidos usando o ensaio Luminex ou Olink que permite que mais de 40 quimiocinas e citocinas séricas sejam medidas simultaneamente.

Viremia de FA e títulos de PRNT: as cargas de viremia de FA serão avaliadas usando PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR). Os títulos de anticorpos neutralizantes anti-YF serão medidos pelo teste de neutralização por redução de placa (PRNT). Resumidamente, 50 PFU (unidades formadoras de placa) do vírus YF17D serão incubadas com diluições seriadas duplas de soro humano por uma hora a 37oC e, em seguida, adicionadas a uma monocamada de células Vero em placas de 24 poços. Uma hora depois, a mídia será aspirada e as células cobertas com carboximetilcelulose 1% em mídia de manutenção. Após 5 dias, as células serão fixadas, lavadas e coradas com cristal violeta. O número de placas será contado e os títulos de PRNT50 determinados usando uma curva dose-resposta sigmóide ajustada como valores recíprocos.

Estudos de scRNA-seq e células T: O sequenciamento de RNA de célula única (scRNA-seq) será realizado em PBMCs isolados antes e após o tratamento com metformina para determinar o impacto do tratamento com metformina em diferentes subconjuntos de células imunes. Este estudo proposto será realizado em colaboração com o Genome Biology Facility em Duke-NUS. Posteriormente, usando os achados do scRNA-seq como um guia, avaliaremos a função e a atividade das células T usando citometria de fluxo ou ensaio de manchas imunoabsorventes ligadas a enzimas (ELISPOT). Esses ensaios serão realizados com equipamentos básicos disponíveis no Programa de Doenças Infecciosas Emergentes em Duke-NUS.