Moduluj stres komórkowy w komórkach odpornościowych, aby zmniejszyć częstość objawowej infekcji wirusowej

Kryteria rekrutacji i proces rekrutacji: Pacjenci będą rekrutowani z bazy danych zdrowych ochotników SingHealth Investigational Medicine Unit (IMU) i plakatów rekrutacyjnych. Uczestnicy otrzymają kopię informacji o uczestniku i formularz świadomej zgody do przeczytania po przybyciu. Sesja informacyjna dotycząca badania zostanie przeprowadzona przez badacza. Następnie osoby badane zostaną wprowadzone do prywatnego pokoju, w którym uzyskuje się świadomą zgodę i gdzie można swobodnie zadawać pytania dotyczące badania. Osoby badane nie będą zmuszane do podejmowania decyzji o udziale w badaniu. Będą zachęcani do rozmowy z członkami rodziny na temat udziału w badaniu; i mogli odroczyć swoją decyzję (bez żadnych uszczerbków) o udziale do czasu omówienia z członkami ich rodzin.

Wizyty i procedury przesiewowe: Pacjenci będą rekrutowani za pośrednictwem Jednostki Medycyny Śledczej SingHealth (IMU). Świadoma pisemna zgoda zostanie uzyskana przed przeprowadzeniem jakiejkolwiek procedury lub oceny związanej z badaniem. Kwalifikacja wszystkich osób do rekrutacji do badania musi zostać oceniona podczas wizyty przesiewowej. Uczestnicy muszą spełniać wszystkie kryteria włączenia i wyłączenia określone odpowiednio w Sekcji 3.3 i Sekcji 3.4, aby kwalifikować się do włączenia do badania. Kryteria kwalifikowalności muszą zostać potwierdzone przed dawkowaniem. Wszystkie kliniczne badania laboratoryjne zaplanowane do badań przesiewowych zostaną zebrane w celu ustalenia poziomu wyjściowego przed podaniem dawki. Inne procedury, które należy wykonać przed rozpoczęciem badania, obejmują pełne badanie fizykalne i test ciążowy z moczu (dla kobiet w wieku rozrodczym).

Wizyty studyjne i procedury: Wszyscy kwalifikujący się uczestnicy przejdą do Dnia 1, gdzie zostaną losowo przydzieleni w stosunku 1:1 do grupy otrzymującej metforminę w dawce 1000 mg lub placebo dwa razy dziennie przez 7 kolejnych dni (dni 1-7). W dniu 4 pacjentom zostanie podana jedna dawka YF17D przed podaniem dawki badanego leku. Uczestnicy zgłoszą się do SingHealth IMU w dniu 1 (lek przed badaniem), dniu 4 (przed YF17D), dniach 5, 7, 11, 14, 18 (tylko dla uczestników, którzy wyrażą zgodę na badania scRNA-seq i komórek T ) i dzień 32 na pobieranie krwi do celów badawczych. Harmonogram pobierania krwi będzie identyczny dla wszystkich grup badawczych. Wszystkie badane próbki krwi będą przechowywane w temperaturze -80oC do czasu zakończenia rekrutacji przed analizą. Rekrutacja pacjentów i pobieranie krwi będą prowadzone jako badanie ambulatoryjne w SingHealth Investigational Medicine Unit (IMU), specjalnej placówce badań klinicznych wczesnej fazy. Na podstawie naszych wcześniejszych doświadczeń przewidujemy, że nie będziemy mieć trudności z rekrutacją wymaganej liczby uczestników do naszego badania, niezbędnej do osiągnięcia docelowej wielkości próby.

Obserwacja i procedury po badaniu: Nie ma wymogu kontynuacji ani procedur po badaniu.

Plan monitorowania bezpieczeństwa: Badanie może zostać ocenione przez inspektorów rządowych/organy regulacyjne, którym należy zezwolić na dostęp do e-CRF, dokumentów źródłowych i innych plików badawczych. Inspektorzy dokonają przeglądu CRF i porównają je z dokumentami źródłowymi, aby zweryfikować poprawność i kompletność zebranych danych oraz potwierdzić, że badanie jest prowadzone zgodnie z protokołem ICH-Good Clinical Practices (ICH-GCP) i wszystkimi obowiązującymi przepisami.

Znane częste działania niepożądane metforminy obejmują biegunkę, nudności, ból brzucha, zgagę i wzdęcia. Rzadkie zdarzenia niepożądane obejmują kwasicę mleczanową i hipoglikemię. Ograniczenie czasu trwania dawkowania metforminy do 10 dni dodatkowo zmniejszyłoby ryzyko wystąpienia tych poważnych zdarzeń niepożądanych. Pacjenci zostaną przeszkoleni w zakresie zwracania uwagi na wczesne objawy związane z tymi zdarzeniami niepożądanymi oraz natychmiastowego zgłaszania się do IMU w przypadku wystąpienia któregokolwiek z tych objawów. Szczegóły dotyczące terminologii zdarzenia AE, daty i godziny rozpoczęcia i zakończenia zdarzenia, ciężkości, zastosowania CTCAE lub zastosowanego leczenia, wpływu na pracę i kontynuację badania oraz ostatecznego wyniku zdarzenia zostaną zapisane w opisie przypadku aż do rozwiązania wydarzenia.

Podczas badania badacz zwerbuje uczestników, a także przeprowadzi pełny wywiad i badanie przedmiotowe zarówno podczas zaplanowanych, jak i nieplanowanych wizyt. Badacz przejrzy również dzienniczki badanego pod kątem potencjalnych skutków ubocznych i zarządza zdarzeniami niepożądanymi w oparciu o najlepszą praktykę kliniczną, jeśli się pojawią. Zgodność z protokołem badania zostanie sprawdzona poprzez zebranie historii przyjmowania leków, liczenie tabletek i kontrolę dzienniczka, a także pomiar poziomu leku metforminy w określonych punktach czasowych.

Zapewnienie jakości danych: PI i Współpracownicy będą okresowo przeglądać badanie pod kątem monitorowania danych i bezpieczeństwa. Wewnętrzne kontrole jakości będą przeprowadzane przez dwie CRC będące członkami zespołu badawczego. Dane wprowadzone przez jeden CRC zostaną sprawdzone przez inny przy użyciu dokumentów źródłowych. Badanie może również zostać wybrane do monitorowania przez SingHealth Office of Research Integrity and Compliance (ORIC) lub ocenione przez rządowych inspektorów/organy regulacyjne, którym należy zezwolić na dostęp do e-CRF, dokumentów źródłowych i innych plików badawczych. Monitorujący/inspektorzy mogą przeglądać CRF i porównywać je z dokumentami źródłowymi, aby zweryfikować poprawność i kompletność zebranych danych oraz potwierdzić, że badanie jest prowadzone zgodnie z protokołem, ICH-Good Clinical Practices (ICH-GCP) i wszystkimi obowiązującymi przepisami.

Wprowadzanie i przechowywanie danych: Wszystkie dane uczestnika zostaną pozbawione elementów umożliwiających identyfikację podczas rekrutacji. Formularze zbierania danych badawczych w formie papierowej, takie jak CRF, dzienniki i dzienniki, będą przechowywane w pliku witryny badacza i przechowywane w SingHealth IMU pod kluczem, dostępnym tylko dla delegowanych członków zespołu badawczego. Bezpośrednie przechwytywanie danych demograficznych i klinicznych zostanie przechwycone w dokumentach źródłowych. Identyfikatory będą przechowywane w oddzielnym pliku w innym biurze i dołożone zostaną wszelkie starania w celu ochrony prywatności uczestników. Dane do analizy będą zawierać wyłącznie dane pozbawione elementów umożliwiających identyfikację. Zastosowany zostanie elektroniczny system zbierania danych. Wszystkie dane elektroniczne będą chronione hasłem i będą dostępne tylko dla członków zespołu badawczego. Próbki, wyniki testów lub dane dotyczące patogenów będą przechowywane w laboratorium Duke-NUS EID na samodzielnym komputerze, do którego dostęp jest chroniony hasłem.

Określenie wielkości próby: Wielkość próby 20 na ramię da 80% mocy do wykrycia zmniejszenia objawów ogólnoustrojowych z 50% do 10% (różnica ryzyka = współczynnik redukcji 0,4 = 0,8) u uczestników otrzymujących placebo w porównaniu z uczestnikami przed leczonych metforminą w porównaniu z grupą otrzymującą placebo przy dwustronnym 5% poziomie błędu typu I (oprogramowanie PASS 13). Biorąc pod uwagę potencjalny wskaźnik rezygnacji wynoszący 10%, całkowita wielkość próby wynosi łącznie 44 (22 na ramię). Z naszych wcześniejszych doświadczeń z rekrutacją uczestników w badaniu szczepionki YF wynika, że ​​w ciągu 1-miesięcznego okresu obserwacji nie było przypadków rezygnacji. Dlatego jesteśmy pewni, że uda nam się zrekrutować wymaganą liczbę osób w okresie próbnym.

Analiza statystyczna: dokładny test Fishera zostanie wykorzystany do oceny różnicy w częstości występowania objawów ogólnoustrojowych między grupą otrzymującą placebo i grupę otrzymującą metforminę przed leczeniem. Przedziały ufności (CI) dla współczynników AE zostaną oszacowane przy użyciu metody dokładnej. CI dla różnicy ryzyka zostanie oszacowany przy użyciu metody punktowej Newcombe'a.

Wykresy diagnostyczne zostaną wykorzystane do określenia wyboru wykorzystania danych surowych lub danych przekształconych logarytmicznie w analizach parametrycznych lub analizach nieparametrycznych. Różnice w mianie przeciwciał neutralizujących anty-YF w dniu 28, wiremii i ekspresji SBREP-1 zostaną porównane między grupami placebo i metforminą. Zależności między objawami ogólnoustrojowymi, molekularnymi korelatami immunogenności, wiremią, mianem przeciwciał i metforminą zostaną zbadane metodami regresji. Różnice w charakterystyce tła między osobnikami, u których występują i nie występują objawy ogólnoustrojowe, zostaną uwzględnione w analizie skorygowanej o współzmienne.

Określenie poziomu badanego leku we krwi: Poziomy badanego leku będą mierzone metodą chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas (LC-MS/MS). Test zostanie przeprowadzony na systemie Shimadzu 8060 LC-MS/MS, który jest dostępny w Singapore General Hospital.

Badania ekspresji genów: Ekspresja genów w pełnej krwi zostanie przeprowadzona przy użyciu testu Nanostring nCounter. Ten test zapewnia multipleksowe podejście do identyfikacji genów, które badacz wcześniej wykorzystał do walidacji trafień z mikromacierzy, które zidentyfikowały adaptacyjny stres ER jako czynnik podatności na objawową infekcję YF17D (patrz dane wstępne). Co ważne, badacz współpracował z Nanostring, aby dostosować kompleksowy zestaw sond, które są w stanie bezpośrednio określić ilościowo transkrypty mRNA w szlakach stresu ER i cyklu TCA, które byłyby genami docelowymi w tej próbie. Podejście to jest również wybierane ze względu na ograniczenia budżetowe CSA. Niemniej jednak zespół badawczy zbierze dodatkowe próbki kliniczne jako kopię zapasową i zbada wykorzystanie RNAseq do odkrycia farmakogenomiki metforminy dzięki dodatkowemu finansowaniu z innych źródeł dotacji.

To proponowane badanie ekspresji genów zostanie przeprowadzone w Centrum Badań Wirusowych i Medycyny Doświadczalnej @ SingHealth Duke-NUS (ViREMiCS). ViREMiCS została założona przez PI i współpracownika, Eng Eong Ooi jako centrum badawcze w partnerstwie SingHealth Duke-NUS Academic Medicine Center. Stworzyła zestaw narzędzi biologii molekularnej i systemowej do wspierania i przyspieszania badań klinicznych potwierdzających słuszność koncepcji. Badacze nie przewidują zatem żadnych problemów w stosowaniu tego podejścia do pomiaru ekspresji genów w próbkach krwi.

Proteomika i profilowanie metaboliczne: Metabolomika osocza zostanie zbadana za pomocą elektroforezy kapilarnej/spektrometrii mas (CE/MS) oraz chromatografii cieczowej/spektrometrii mas LC-MS/MS, tak jak wcześniej stosowaliśmy do pomiaru polarnych metabolitów z cyklu glikolizy i TCA [18 , 25]. Proteomika zostanie zmierzona przy użyciu LC-MS/MS. Testy te zostaną przeprowadzone przy użyciu podstawowego sprzętu dostępnego w programie Program in Emerging Infectious Diseases i Metabolomics Core Facility, oba w Duke-NUS. Umożliwi to podejście multiomiczne w celu wspierania udoskonalonych spostrzeżeń biologicznych.

Chemokiny i cytokiny: Poziomy chemokin i cytokin w surowicy będą mierzone za pomocą testu Luminex lub Olink, który umożliwia jednoczesny pomiar ponad 40 chemokin i cytokin w surowicy.

Miana YF wiremii i PRNT: miana YF wiremii zostaną ocenione przy użyciu ilościowego PCR w czasie rzeczywistym (qRT-PCR). Miana przeciwciał neutralizujących anty-YF będą mierzone za pomocą testu neutralizacji redukcji płytek (PRNT). W skrócie, 50 PFU (jednostek tworzących łysinki) wirusa YF17D będzie inkubowane z 2-krotnymi seryjnymi rozcieńczeniami ludzkiej surowicy przez jedną godzinę w 37oC, a następnie dodane do pojedynczej warstwy komórek Vero w 24-studzienkowych płytkach. Godzinę później pożywki zostaną odessane, a komórki pokryte 1% karboksymetylocelulozą w pożywce podtrzymującej. Po 5 dniach komórki zostaną utrwalone, przemyte i wybarwione fioletem krystalicznym. Liczba łysinek zostanie policzona, a miana PRNT50 określone przy użyciu esowatej krzywej dawka-odpowiedź dopasowanej jako wartości odwrotne.

Badania scRNA-seq i komórek T: Sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki (scRNA-seq) zostanie przeprowadzone na PBMC wyizolowanych przed i po leczeniu metforminą w celu określenia wpływu leczenia metforminą na różne podzbiory komórek odpornościowych. Proponowane badanie zostanie przeprowadzone we współpracy z Genome Biology Facility w Duke-NUS. Następnie, wykorzystując wyniki scRNA-seq jako przewodnika, ocenimy funkcję i aktywność komórek T za pomocą cytometrii przepływowej lub testu enzymatycznego absorbentu immunologicznego (ELISPOT). Testy te zostaną przeprowadzone przy użyciu podstawowego sprzętu dostępnego w Programie pojawiających się chorób zakaźnych w Duke-NUS.