Moduloi solujen stressiä immuunisoluissa oireisen virusinfektion vähentämiseksi

Rekrytointi- ja rekrytointiprosessin kriteerit: Tutkittavat rekrytoidaan SingHealth Investigational Medicine Unit (IMU) terveiden vapaaehtoisten tietokannasta ja rekrytointijulisteista. Koehenkilöille annetaan kopio osallistujatieto- ja suostumuslomakkeesta luettavaksi heidän saapuessaan. Tutkija pitää tutkimuksesta tiedotustilaisuuden. Tämän jälkeen koehenkilöt ohjataan yksityiseen huoneeseen, jossa hankitaan tietoinen suostumus ja jossa tutkimukseen liittyviä kysymyksiä voidaan esittää vapaasti. Koehenkilöitä ei kiirehdi tekemään päätöstä osallistua tutkimukseen. Heitä rohkaistaan ​​puhumaan perheenjäsenilleen tutkimukseen osallistumisesta; ja he saivat lykätä päätöstään osallistua (ilman mitään rajoituksia) siihen asti, kun heidän perheenjäsentensä kanssa on keskusteltu.

Seulontakäynnit ja -menettelyt: Tutkittavat rekrytoidaan SingHealth Investigational Medicine Unit (IMU) -yksikön kautta. Tietoinen kirjallinen suostumus hankitaan ennen minkään tutkimukseen liittyvän menettelyn tai arvioinnin suorittamista. Kaikkien koehenkilöiden kelpoisuus tutkimukseen on arvioitava seulontakäynnin aikana. Koehenkilöiden on täytettävä kaikki osiossa 3.3 ja osiossa 3.4 esitetyt sisällyttämis- ja poissulkemiskriteerit, jotta he voivat osallistua tutkimukseen. Kelpoisuuskriteerit on vahvistettava ennen annostelua. Kaikki seulontaan suunnitellut kliiniset laboratoriokokeet kerätään annosta edeltävän lähtötilanteen määrittämiseksi. Muita toimenpiteitä, jotka on suoritettava ennen tutkimuksen alkamista, ovat täydellinen fyysinen tarkastus ja virtsaraskaustesti (hedelmällisessä iässä oleville naisille).

Tutkimuskäynnit ja menettelyt: Kaikki kelvolliset koehenkilöt jatkavat päivään 1, jossa heidät satunnaistetaan 1:1 joko metformiinia 1000 mg tai lumelääkettä kahdesti päivässä 7 peräkkäisenä päivänä (päivät 1-7). Päivänä 4 koehenkilöille annetaan yksi annos YF17D:tä ennen tutkimuslääkkeen annostelua. Koehenkilöt raportoivat SingHealth IMU:lle päivänä 1 (esitutkimuslääke), päivänä 4 (ennen YF17D:tä), päivinä 5, 7, 11, 14, 18 (vain osallistujille, jotka suostuvat scRNA-seq- ja T-solututkimuksiin ) ja 32. päivä tutkimusverinäytteitä varten. Verenottoaikataulu on kaikille tutkimusryhmille sama. Kaikki tutkimusverinäytteet säilytetään -80 oC:ssa, kunnes rekrytointi on suoritettu ennen analysointia. Koehenkilöiden rekrytointi ja verenotto suoritetaan avohoitotutkimuksena SingHealth Investigational Medicine Unit (IMU) -yksikössä, joka on varhaisen vaiheen kliinisille tutkimuksille varattu laitos. Aiemman kokemuksemme perusteella odotamme, että meillä ei ole vaikeuksia rekrytoida tarvittavaa määrää osallistujia tutkimukseemme, joka on tarpeen tavoiteotoskoon saavuttamiseksi.

Tutkimuksen jälkeinen seuranta ja menettelyt: Tutkimuksen jälkeistä seurantaa tai menettelyjä ei vaadita.

Turvallisuuden seurantasuunnitelma: Valtion tarkastajat/sääntelyviranomaiset voivat arvioida tutkimuksen, joille on annettava pääsy e-CRF:iin, lähdeasiakirjoihin ja muihin tutkimustiedostoihin. Tarkastajat tarkistavat CRF:t ja vertaavat niitä lähdeasiakirjoihin varmistaakseen tarkan ja täydellisen tiedonkeruun ja vahvistavat, että tutkimus suoritetaan protokollan, ICH-Good Clinical Practices (ICH-GCP) ja kaikkien sovellettavien määräysten mukaisesti.

Tunnettuja metformiinin yleisiä haittavaikutuksia ovat ripuli, pahoinvointi, vatsakipu, närästys ja turvotus. Harvinaisia ​​haittavaikutuksia ovat maitohappoasidoosi ja hypoglykemia. Metformiinin annoksen keston rajoittaminen 10 päivään vähentäisi entisestään näiden vakavien haittavaikutusten riskiä. Koehenkilöt koulutetaan tarkkailemaan näihin haittavaikutuksiin liittyviä varhaisia ​​oireita ja ilmoittamaan välittömästi IMU:lle, jos heillä on jokin näistä oireista. AE-tapahtuman terminologian yksityiskohdat, tapahtuman alkamis- ja päättymispäivämäärä ja -aika, vakavuus, CTCAE:n käyttö tai annettu hoito, vaikutus työhön ja tutkimuksen jatkamiseen sekä tapahtuman lopullinen tulos kirjataan tapausraporttiin ratkaisuun asti tapahtumasta.

Tutkimuksen aikana tutkija rekrytoi koehenkilöt sekä suorittaa täyden historiankeräyksen ja fyysisen tarkastuksen sekä suunnitelluilla että suunnittelemattomilla vierailuilla. Tutkija tarkistaa myös potilaan päiväkirjat mahdollisten sivuvaikutusten varalta ja hallitsee haittavaikutuksia parhaan kliinisen käytännön perusteella, jos niitä ilmenee. Tutkimusprotokollan noudattaminen tarkistetaan ottamalla lääkityshistoria ja pillerimäärä ja tarkastelemalla päiväkirja sekä mittaamalla metformiinilääketaso tiettyinä ajankohtina.

Tietojen laadunvarmistus: PI ja Co-I tarkastelevat tutkimusta säännöllisesti tietojen ja turvallisuuden seurantaa varten. Sisäiset laatutarkastukset suorittaa kaksi CRC:tä, jotka ovat tutkimusryhmän jäseniä. Yhden CRC:n syöttämät tiedot tarkistaa toinen lähdedokumenttien avulla. SingHealth Office of Research Integrity and Compliance (ORIC) voi myös valita tutkimuksen seurantaan, tai valtion tarkastajat/sääntelyviranomaiset voivat arvioida tutkimuksen, joille on annettava pääsy e-CRF:iin, lähdeasiakirjoihin ja muihin tutkimustiedostoihin. Monitorit/tarkastajat voivat tarkistaa CRF:t ja verrata niitä lähdeasiakirjoihin varmistaakseen tarkan ja täydellisen tiedonkeruun ja varmistaakseen, että tutkimus suoritetaan protokollan, ICH-Good Clinical Practices (ICH-GCP) ja kaikkien sovellettavien määräysten mukaisesti.

Tietojen syöttö ja tallennus: Kaikki osallistujan tiedot poistetaan henkilöllisyydestä rekrytoinnin yhteydessä. Painetut tutkimustiedonkeruulomakkeet, kuten CRF:t, lokit ja päiväkirjat, säilytetään tutkijan sivustotiedostossa ja säilytetään SingHealth IMU:ssa lukittuna ja vain valtuutettujen tutkimusryhmän jäsenten saatavilla. Demografisten ja kliinisten tietojen suora tiedonkeruu kaapataan lähdeasiakirjoihin. Tunnisteet säilytetään erillisessä tiedostossa toisessa toimistossa ja osallistujien yksityisyys pyritään kaikin tavoin suojelemaan. Analysoitavat tiedot sisältävät vain tunnistamattomia tietoja. Käytössä on sähköinen tiedonkeruujärjestelmä. Kaikki sähköiset tiedot on suojattu salasanalla ja vain tutkimusryhmän jäsenillä on pääsy niihin. Näytteet, testitulokset tai patogeenitiedot tallennetaan Duke-NUS EID -laboratorioon erillisessä tietokoneessa, jossa pääsy on suojattu salasanalla.

Näytteen koon määrittäminen: Otoskoko 20 per käsi antaa 80 %:n tehon havaita systeemisten oireiden väheneminen 50 %:sta 10 %:iin (riskiero = 0,4 vähennyssuhde = 0,8) lumelääkettä saaneilla osallistujilla verrattuna ennen hoitoa saaviin potilaisiin. hoidettiin metformiinilla plaseboryhmään verrattuna 2-puolisella 5 %:n tyypin I virhetasolla (PASS 13 Software). Kun huomioidaan 10 %:n mahdollinen keskeyttämisaste, kokonaisotoskoko on yhteensä 44 (22 per käsi). Aiemman kokemuksemme perusteella koehenkilöiden rekrytoinnista YF-rokotetutkimuksessa ei ollut keskeyttäneitä yhden kuukauden seurantajakson aikana. Siksi olemme varmoja, että voimme rekrytoida tarvittavan määrän koehenkilöitä koeajan kuluessa.

Tilastollinen analyysi: Fisherin tarkkaa testiä käytetään arvioimaan eroa systeemisten oireiden välillä lumelääkettä ja metformiinia edeltävän ryhmän välillä. AE-arvojen luottamusvälit (CI) arvioidaan tarkkaa menetelmää käyttäen. Riskien eron CI arvioidaan Newcomben pisteytysmenetelmällä.

Diagnostisia käyriä käytetään määritettäessä, käytetäänkö raakadataa vai logaritmiltaan muunnettuja tietoja parametrisissä analyyseissä tai ei-parametrisissa analyyseissä. Eroja anti-YF:ää neutraloivassa vasta-ainetiitterissä 28. päivänä, viremiassa ja SBREP-1:n ilmentymisessä verrataan lume- ja metformiiniryhmien välillä. Systeemisten oireiden, immunogeenisyyden molekyylikorrelaattien, viremian, vasta-ainetiitterin ja metformiinin välistä suhdetta tutkitaan regressiomenetelmillä. Taustaominaisuuksien erot sellaisten koehenkilöiden välillä, joilla on ja joilla ei ole systeemisiä oireita, sisällytetään kovariaattisovitettuun analyysiin.

Tutkimuslääketason määritys veressä: Tutkimuslääketasot mitataan nestekromatografia-tandem-massaspektrometrisellä (LC-MS/MS) -määritysmenetelmällä. Määritys suoritetaan Shimadzu 8060 LC-MS/MS -järjestelmällä, joka on saatavilla Singaporen yleissairaalassa.

Geeniekspressiotutkimukset: Geenien ilmentyminen kokoveressä suoritettaisiin käyttämällä Nanostring nCounter -määritystä. Tämä määritys tarjoaa multiplex-lähestymistavan tunnistamaan geenit, joita tutkija on aiemmin käyttänyt validoidakseen osumia mikrosiruista, jotka tunnistivat adaptiivisen ER-stressin alttiustekijäksi oireelliselle YF17D-infektiolle (katso alustavat tiedot). Tärkeää on, että tutkija on työskennellyt Nanostringin kanssa räätälöidäkseen kattavan joukon koettimia, jotka pystyvät määrittämään suoraan mRNA-transkriptit ER-stressi- ja TCA-kiertoreiteissä, jotka olisivat tämän tutkimuksen kohdegeenejä. Tämä lähestymistapa on valittu myös CSA:n budjettirajoitteen vuoksi. Siitä huolimatta tutkimusryhmä kerää ylimääräisiä kliinisiä näytteitä varmuuskopiona ja tutkii RNAseqin käyttöä metformiinin farmakogenomiikan löytämiseksi muiden apurahalähteiden lisärahoituksella.

Tämä ehdotettu geeniekspressiotutkimus suoritetaan Viral Research and Experimental Medicine Centerissä @ SingHealth Duke-NUS (ViREMiCS). ViREMiCSin perusti PI ja yhteistyökumppani Eng Eong Ooi tutkimuskeskukseksi SingHealth Duke-NUS Academic Medicine Center -yhteistyössä. Se on perustanut sarjan molekyyli- ja systeemibiologian työkaluja tukemaan ja nopeuttamaan kliinisiä tutkimuksia. Näin ollen tutkijat eivät ennakoi mitään ongelmaa tämän lähestymistavan käyttämisessä geenin ilmentymisen mittaamiseen verinäytteissä.

Proteomiikka ja aineenvaihduntaprofilointi: Plasman metabolomiikkaa tutkitaan käyttämällä kapillaarielektroforeesia/massaspektrometriaa (CE/MS) ja nestekromatografiaa/massaspektrometriaa LC-MS/MS, kuten olemme aiemmin käyttäneet mittaamaan polaarisia metaboliitteja glykolyysistä ja TCA-syklistä [18 , 25]. Proteomiikka mitataan LC-MS/MS:llä. Nämä määritykset suoritetaan käyttäen ydinlaitteita, jotka ovat saatavilla Emerging Infectious Diseases and Metabolmics Core Facility -ohjelmassa, molemmat Duke-NUSissa. Tämä mahdollistaa multi-omics-lähestymistavan, joka tukee parempia biologisia oivalluksia.

Kemokiini ja sytokiini: Seerumin kemokiini- ja sytokiinitasot mitataan Luminex- tai Olink-määrityksellä, joka mahdollistaa yli 40 seerumin kemokiinin ja sytokiinin mittaamisen samanaikaisesti.

YF-viremia- ja PRNT-tiitterit: YF-viremiakuormitukset arvioidaan käyttämällä kvantitatiivista reaaliaikaista PCR:ää (qRT-PCR). Anti-YF-neutralointivasta-ainetiitterit mitataan plakin vähentämisneutralointitestillä (PRNT). Lyhyesti sanottuna 50 PFU:ta (plakkia muodostavaa yksikköä) YF17D-virusta inkuboidaan 2-kertaisten ihmisseerumin sarjalaimennosten kanssa tunnin ajan 37 °C:ssa ja lisätään sitten Vero-solujen yksikerroksiseen kerrokseen 24-kuoppalevyillä. Tuntia myöhemmin väliaine imetään ja solut peitetään 1-prosenttisella karboksimetyyliselluloosalla ylläpitoväliaineessa. 5 päivän kuluttua solut kiinnitetään, pestään ja värjätään kristallivioletilla. Plakkien lukumäärä lasketaan ja PRNT50-tiitterit määritetään käyttämällä sigmoidista annos-vastekäyrää sovitettuna käänteisarvoina.

scRNA-seq- ja T-solututkimukset: Yksisoluinen RNA-sekvensointi (scRNA-seq) suoritetaan PBMC:ille, jotka on eristetty ennen metformiinihoitoa ja sen jälkeen, jotta voidaan määrittää metformiinihoidon vaikutus immuunisolujen eri alaryhmiin. Tämä ehdotettu tutkimus suoritetaan yhteistyössä Duke-NUSin genomibiologian laitoksen kanssa. Myöhemmin scRNA-seq:n löydöksiä käyttämällä arvioimme sitten T-solujen toiminnan ja aktiivisuuden käyttämällä joko virtaussytometriaa tai entsyymikytkentäistä immuuniabsorbenttitäplää (ELISPOT) -määritystä. Nämä määritykset suoritetaan käyttämällä Duke-NUSin kehittyvien tartuntatautien ohjelmassa saatavilla olevia ydinlaitteita.