Modular el estrés celular en las células inmunitarias para reducir la tasa de infección viral sintomática

Criterios para el reclutamiento y el proceso de reclutamiento: los sujetos se reclutarán de la base de datos de voluntarios sanos de la Unidad de Medicina de Investigación (IMU) de SingHealth y de los carteles de reclutamiento. Los sujetos recibirán una copia de la Información del participante y el Formulario de consentimiento informado para leer a su llegada. El investigador llevará a cabo una sesión informativa sobre el estudio. Posteriormente, los sujetos serán conducidos a una habitación privada donde se obtiene el consentimiento informado y donde se pueden hacer preguntas libremente sobre el estudio. No se apresurará a los sujetos a tomar la decisión de participar en el estudio. Se les animará a hablar con sus familiares sobre la participación en el estudio; y se les permitió aplazar su decisión (sin ningún perjuicio) de participar hasta después de discutirlo con sus familiares.

Visitas y procedimientos de selección: los sujetos se reclutarán a través de la Unidad de Medicina de Investigación (IMU) de SingHealth. Se obtendrá el consentimiento informado por escrito antes de realizar cualquier procedimiento o evaluación relacionada con el estudio. La elegibilidad de todos los sujetos para el reclutamiento en el estudio debe evaluarse durante la visita de selección. Los sujetos deben cumplir con todos los criterios de inclusión y exclusión descritos en la Sección 3.3 y la Sección 3.4 respectivamente para ser elegibles para la inscripción en el estudio. Los criterios de elegibilidad deben confirmarse antes de la dosificación. Se recopilarán todas las pruebas de laboratorio clínico programadas para la detección para establecer la línea de base previa a la dosis. Otros procedimientos que deben completarse antes de que comience el estudio incluyen un examen físico completo y una prueba de embarazo en orina (para mujeres en edad fértil).

Visitas y procedimientos del estudio: Todos los sujetos elegibles pasarán al Día 1, donde serán aleatorizados 1:1 a metformina 1000 mg o placebo dos veces al día durante 7 días consecutivos (Días 1-7). El día 4, a los sujetos se les administrará una dosis de YF17D antes de la dosificación del fármaco del estudio. Los sujetos se presentarán en la IMU de SingHealth el día 1 (medicamento previo al estudio), el día 4 (pre-YF17D), los días 5, 7, 11, 14, 18 (solo para participantes que den su consentimiento para estudios de scRNA-seq y células T ) y el día 32 para la toma de muestras de sangre para investigación. El calendario de extracciones de sangre será idéntico para todos los grupos de estudio. Todas las muestras de sangre de investigación se almacenarán a -80oC hasta que se complete el reclutamiento antes del análisis. El reclutamiento de sujetos y la recolección de sangre se llevarán a cabo como un estudio ambulatorio en la Unidad de Medicina de Investigación (IMU) de SingHealth, una instalación dedicada a ensayos clínicos de fase inicial. A partir de nuestra experiencia previa, anticipamos que no tendremos dificultades para reclutar la cantidad necesaria de participantes en nuestro estudio para cumplir con el tamaño de muestra objetivo.

Seguimiento y procedimientos posteriores al estudio: No hay requisitos para el seguimiento o los procedimientos posteriores al estudio.

Plan de monitoreo de seguridad: el estudio puede ser evaluado por inspectores gubernamentales/autoridades reguladoras a quienes se les debe permitir el acceso a los e-CRF, documentos fuente y otros archivos del estudio. Los inspectores revisarán los CRF y los compararán con los documentos fuente para verificar la recopilación precisa y completa de datos y confirmar que el estudio se lleva a cabo de acuerdo con el protocolo, ICH-Good Clinical Practices (ICH-GCP) y todas las reglamentaciones aplicables.

Los eventos adversos comunes conocidos de la metformina incluyen diarrea, náuseas, dolor de estómago, acidez estomacal e hinchazón. Los EA raros incluyen acidosis láctica e hipoglucemia. Limitar la duración de la dosificación de metformina a 10 días reduciría aún más el riesgo de estos eventos adversos graves. Se entrenará a los sujetos para que estén atentos a los primeros síntomas asociados con estos EA y para informar a la IMU de inmediato si experimentan alguno de estos síntomas. Los detalles de la terminología del evento EA, la fecha y la hora de inicio y finalización del evento, la gravedad, el uso de CTCAE o el tratamiento administrado, el impacto en el trabajo y en la continuación del estudio y el resultado final del evento se registrarán en el informe del caso hasta su resolución. del evento.

Durante el estudio, el investigador reclutará a los sujetos, además de realizar un historial completo y un examen físico en las visitas programadas y no programadas. El investigador también revisará los diarios del sujeto en busca de posibles efectos secundarios y manejará los eventos adversos según las mejores prácticas clínicas en caso de que surjan. El cumplimiento del protocolo del estudio se verificará tomando un historial de medicamentos, un recuento de píldoras y una inspección del diario, así como la medición del nivel de metformina en puntos de tiempo específicos.

Garantía de calidad de los datos: el PI y los Co-I revisarán el estudio periódicamente para monitorear los datos y la seguridad. Los controles de calidad internos serán realizados por dos CRC que son miembros del equipo de estudio. Los datos ingresados ​​por un CRC serán verificados por otro utilizando los documentos fuente. El estudio también puede ser seleccionado para el monitoreo por parte de la Oficina de Integridad y Cumplimiento de la Investigación (ORIC) de SingHealth o evaluado por inspectores gubernamentales/autoridades reguladoras a quienes se les debe permitir el acceso a los e-CRF, documentos fuente y otros archivos del estudio. Los monitores/inspectores pueden revisar los CRF y compararlos con los documentos fuente para verificar la recopilación precisa y completa de datos y confirmar que el estudio se lleva a cabo de acuerdo con el protocolo, ICH-Good Clinical Practices (ICH-GCP) y todas las reglamentaciones aplicables.

Entrada y almacenamiento de datos: todos los datos de los participantes serán desidentificados en el momento de la contratación. Los formularios de recopilación de datos de investigación en papel, como CRF, registros y diarios, se mantendrán en el Archivo del sitio del investigador y se almacenarán en SingHealth IMU bajo llave, accesibles solo para los miembros delegados del equipo de estudio. La captura directa de datos demográficos y clínicos se capturará en los documentos fuente. Los identificadores se mantendrán en un archivo separado en otra oficina y se hará todo lo posible para proteger la privacidad de los participantes. Los datos a analizar contendrán únicamente datos no identificados. Se utilizará un sistema electrónico de captura de datos. Todos los datos electrónicos estarán protegidos con contraseña y solo los miembros del equipo de estudio podrán acceder a ellos. Las muestras, los resultados de las pruebas o los datos de patógenos se almacenarán en el laboratorio Duke-NUS EID en una PC independiente cuyo acceso está protegido por contraseña.

Determinación del tamaño de la muestra: un tamaño de muestra de 20 por brazo dará un poder del 80 % para detectar una reducción en los síntomas sistémicos del 50 % al 10 % (diferencia de riesgo = 0,4 índice de reducción = 0,8) en los participantes que reciben placebo versus los que reciben tratamiento previo. tratados con metformina versus grupo placebo con una tasa de error de tipo I del 5 % de 2 colas (software PASS 13). Teniendo en cuenta una tasa de abandono potencial del 10 %, el tamaño total de la muestra es de 44 en total (22 por brazo). De nuestra experiencia anterior con el reclutamiento de sujetos en el ensayo de la vacuna YF, no hubo abandonos durante el período de seguimiento de 1 mes. Por lo tanto, estamos seguros de que podemos reclutar el número requerido de sujetos dentro del período de prueba.

Análisis estadístico: se utilizará la prueba exacta de Fisher para evaluar la diferencia en la tasa de síntomas sistémicos entre el brazo de pretratamiento con placebo y el de metformina. Los intervalos de confianza (IC) para las tasas de EA se estimarán utilizando el método exacto. El IC para la diferencia de riesgo se estimará mediante el método de puntuación de Newcombe.

Se utilizarán gráficos de diagnóstico para determinar la opción de utilizar los datos sin procesar o los datos transformados logarítmicamente en análisis paramétricos o análisis no paramétricos. Las diferencias en el título de anticuerpos neutralizantes anti-YF en el día 28, la viremia y la expresión de SBREP-1 se compararán entre los grupos de placebo y metformina. La relación entre los síntomas sistémicos, los correlatos moleculares de la inmunogenicidad, la viremia, el título de anticuerpos y la metformina se explorarán con métodos de regresión. Las diferencias en las características de fondo entre los sujetos que tienen y los que no tienen inicio de síntomas sistémicos se incluirán en el análisis ajustado por covariables.

Determinación del nivel en sangre del fármaco del estudio: los niveles del fármaco del estudio se medirán mediante un método de ensayo de cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS). El ensayo se realizará en un sistema Shimadzu 8060 LC-MS/MS, que está disponible en el Hospital General de Singapur.

Estudios de expresión génica: la expresión génica en sangre completa se llevaría a cabo mediante el ensayo Nanostring nCounter. Este ensayo proporciona un enfoque multiplex para identificar los genes que el investigador utilizó previamente para validar los resultados del microarreglo que identificó el estrés adaptativo del RE como un factor de susceptibilidad para la infección sintomática de YF17D (consulte los datos preliminares). Es importante destacar que el investigador ha trabajado con Nanostring para personalizar un conjunto integral de sondas que pueden cuantificar directamente las transcripciones de ARNm en las vías del ciclo de estrés ER y TCA, que serían los genes objetivo en este ensayo. Este enfoque también se elige debido a la restricción presupuestaria de la CSA. No obstante, el equipo de estudio recolectará muestras clínicas adicionales como respaldo y explorará el uso de RNAseq para descubrir la farmacogenómica de la metformina a través de fondos adicionales de otras fuentes de subvenciones.

Este estudio de expresión génica propuesto se llevará a cabo en el Centro de Medicina Experimental e Investigación Viral @ SingHealth Duke-NUS (ViREMiCS). ViREMiCS fue establecido por el IP y colaborador, Eng Eong Ooi, como un centro de investigación en la asociación SingHealth Duke-NUS Academic Medicine Center. Ha establecido un conjunto de herramientas de biología molecular y de sistemas para respaldar y acelerar los ensayos clínicos de prueba de concepto. Por lo tanto, los investigadores no anticipan ningún problema al usar este enfoque para medir la expresión génica en muestras de sangre.

Perfiles de proteómica y metabolómica: la metabolómica del plasma se examinará mediante electroforesis capilar/espectrometría de masas (CE/MS) y cromatografía líquida/espectrometría de masas LC-MS/MS como hemos empleado anteriormente para medir los metabolitos polares de la glucólisis y el ciclo TCA [18 , 25]. La proteómica se medirá utilizando LC-MS/MS. Estos ensayos se llevarán a cabo utilizando el equipo central disponible en el Programa de Enfermedades Infecciosas Emergentes y la Instalación Central de Metabolómica, ambos en Duke-NUS. Esto permitirá un enfoque multiómico para respaldar conocimientos biológicos mejorados.

Quimiocinas y citocinas: los niveles de quimiocinas y citocinas en suero se medirán mediante el ensayo Luminex u Olink, que permite medir simultáneamente más de 40 quimiocinas y citocinas en suero.

Títulos de viremia YF y PRNT: las cargas de viremia YF se evaluarán mediante PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR). Los títulos de anticuerpos neutralizantes anti-YF se medirán mediante la prueba de neutralización por reducción de placas (PRNT). Brevemente, se incubarán 50 PFU (unidades formadoras de placa) del virus YF17D con diluciones en serie dobles de suero humano durante una hora a 37 °C y luego se agregarán a una monocapa de células Vero en placas de 24 pocillos. Una hora más tarde, se aspirarán los medios y se cubrirán las células con carboximetilcelulosa al 1 % en medios de mantenimiento. Después de 5 días, las células se fijarán, lavarán y teñirán con cristal violeta. Se contará el número de placas y se determinarán los títulos de PRNT50 utilizando un ajuste de curva dosis-respuesta sigmoide como valores recíprocos.

Estudios de scRNA-seq y células T: la secuenciación de ARN de células individuales (scRNA-seq) se realizará en PBMC aisladas antes y después del tratamiento con metformina para determinar el impacto del tratamiento con metformina en diferentes subconjuntos de células inmunitarias. Este estudio propuesto se llevará a cabo en colaboración con el Centro de biología del genoma en Duke-NUS. Posteriormente, utilizando los hallazgos de scRNA-seq como guía, evaluaremos la función y la actividad de las células T mediante citometría de flujo o ensayo de punto inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISPOT). Estos ensayos se llevarán a cabo utilizando equipos básicos disponibles en el Programa de Enfermedades Infecciosas Emergentes en Duke-NUS.