Модулировать клеточный стресс в иммунных клетках, чтобы снизить скорость симптоматической вирусной инфекции

Критерии набора и процесс набора: Субъекты будут набраны из базы данных здоровых добровольцев SingHealth Investigative Medicine Unit (IMU) и плакатов набора. Субъектам будет предоставлена ​​копия Формы информации об участнике и информированного согласия, которую они должны прочитать по прибытии. Инструктаж по исследованию будет проводиться исследователем. После этого субъекты будут проведены в отдельную комнату, где будет получено информированное согласие и где можно будет свободно задавать вопросы об исследовании. Субъекты не будут торопиться с принятием решения об участии в исследовании. Им будет предложено поговорить с членами своей семьи об участии в исследовании; и разрешили отложить свое решение (без каких-либо предубеждений) об участии до обсуждения с членами их семей.

Визиты и процедуры скрининга: Субъекты будут набираться через Отделение исследовательской медицины (IMU) SingHealth. Перед выполнением любой процедуры или оценки, связанной с исследованием, будет получено информированное письменное согласие. Приемлемость всех субъектов для включения в исследование должна быть оценена во время скринингового визита. Субъекты должны соответствовать всем критериям включения и исключения, изложенным в Разделе 3.3 и Разделе 3.4 соответственно, чтобы иметь право на участие в исследовании. Критерии приемлемости должны быть подтверждены перед дозированием. Все клинические лабораторные тесты, запланированные для скрининга, будут собраны для установления исходного уровня перед введением дозы. Другие процедуры, которые должны быть выполнены до начала исследования, включают полное медицинское обследование и анализ мочи на беременность (для женщин с детородным потенциалом).

Учебные визиты и процедуры: Все подходящие субъекты перейдут к 1-му дню, где они будут рандомизированы 1:1 для приема метформина 1000 мг или плацебо два раза в день в течение 7 последовательных дней (дни 1-7). На 4-й день субъектам будет введена одна доза YF17D перед введением дозы исследуемого препарата. Субъекты будут отчитываться перед SingHealth IMU в день 1 (препарат перед исследованием), день 4 (до YF17D), дни 5, 7, 11, 14, 18 (только для участников, давших согласие на исследования scRNA-seq и Т-клеток). ) и 32-й день для забора крови для исследования. График забора крови будет одинаковым для всех исследовательских групп. Все образцы крови для исследований будут храниться при температуре -80°C до тех пор, пока набор не будет завершен перед анализом. Набор субъектов и сбор крови будут проводиться в рамках амбулаторного исследования в SingHealth Investigational Medicine Unit (IMU), специализированном центре клинических испытаний на ранней стадии. Исходя из нашего предыдущего опыта, мы ожидаем, что у нас не возникнет трудностей с набором необходимого количества участников в наше исследование, необходимого для достижения целевого размера выборки.

Последующее наблюдение и процедуры после исследования: Последующее наблюдение или процедуры после исследования не требуются.

План мониторинга безопасности: исследование может быть оценено государственными инспекторами/регулирующими органами, которым должен быть предоставлен доступ к электронным ИРК, исходным документам и другим файлам исследования. Инспекторы просматривают CRF и сравнивают их с исходными документами, чтобы проверить точность и полноту сбора данных и подтвердить, что исследование проводится в соответствии с протоколом, надлежащей клинической практикой ICH (ICH-GCP) и всеми применимыми правилами.

Известные общие побочные эффекты метформина включают диарею, тошноту, боль в желудке, изжогу и вздутие живота. Редкие НЯ включают лактоацидоз и гипогликемию. Ограничение продолжительности приема метформина до 10 дней еще больше снизит риск этих серьезных НЯ. Субъекты будут обучены выявлять ранние симптомы, связанные с этими НЯ, и немедленно сообщать в IMU, если у них возникнут какие-либо из этих симптомов. Подробная информация о терминологии явления НЯ, дате и времени начала и окончания события, серьезности, использовании CTCAE или назначенного лечения, влиянии на работу и на продолжение исследования, а также окончательный результат события будут регистрироваться в отчете о случае до разрешения. события.

Во время исследования исследователь набирает субъектов, а также проводит полный сбор анамнеза и медицинский осмотр как во время плановых, так и внеплановых посещений. Исследователь также просматривает дневники субъекта на предмет любых потенциальных побочных эффектов и лечит НЯ на основе передовой клинической практики, если они возникают. Соблюдение протокола исследования будет проверено путем сбора анамнеза приема лекарств, подсчета таблеток и проверки дневника, а также измерения уровня препарата метформина в определенные моменты времени.

Обеспечение качества данных: PI и Co-I будут периодически проверять исследование на предмет данных и мониторинга безопасности. Внутренние проверки качества будут выполняться двумя CRC, которые являются членами исследовательской группы. Данные, введенные одним CRC, будут проверены другим по исходным документам. Исследование также может быть выбрано для мониторинга Управлением честности и соответствия исследований SingHealth (ORIC) или оценено государственными инспекторами/регулирующими органами, которым должен быть предоставлен доступ к электронным ИРК, исходным документам и другим файлам исследования. Наблюдатели/инспекторы могут просматривать CRF и сравнивать их с исходными документами, чтобы проверить точность и полноту сбора данных и подтвердить, что исследование проводится в соответствии с протоколом, ICH-Good Clinical Practices (ICH-GCP) и всеми применимыми правилами.

Ввод и хранение данных: все данные участников будут деидентифицированы при наборе. Печатные формы для сбора исследовательских данных, такие как CRF, журналы и дневники, будут храниться в файле сайта исследователя и храниться в SingHealth IMU под замком, доступном только для делегированных членов исследовательской группы. Непосредственный сбор демографических и клинических данных будет зафиксирован в исходных документах. Идентификаторы будут храниться в отдельном файле в другом офисе, и будут приложены все усилия для защиты конфиденциальности участников. Анализируемые данные будут содержать только деидентифицированные данные. Будет использоваться электронная система сбора данных. Все электронные данные будут защищены паролем и могут быть доступны только членам исследовательской группы. Образцы, результаты анализов или данные о патогенах будут храниться в лаборатории EID Duke-NUS на отдельном ПК, доступ к которому защищен паролем.

Определение размера выборки: размер выборки 20 человек на группу даст 80% мощности для выявления снижения системных симптомов с 50% до 10% (разница риска = 0,4, коэффициент снижения = 0,8) у участников, получающих плацебо, по сравнению с теми, кто предварительно лечение метформином по сравнению с группой плацебо при двусторонней частоте ошибок типа I 5% (программное обеспечение PASS 13). С учетом потенциального отсева в 10% общий размер выборки составляет 44 человека (22 человека на группу). Судя по нашему предыдущему опыту набора субъектов в испытаниях вакцины против желтой лихорадки, в течение 1-месячного периода наблюдения не было ни одного случая выбывания. Поэтому мы уверены, что сможем набрать необходимое количество испытуемых в течение испытательного периода.

Статистический анализ: точный критерий Фишера будет использоваться для оценки различий в частоте системных симптомов между группами плацебо и метформина до лечения. Доверительные интервалы (ДИ) для показателей НЯ будут оцениваться с использованием точного метода. CI для разницы рисков будет оцениваться с использованием метода оценки Ньюкомба.

Диагностические графики будут использоваться для определения выбора использования необработанных данных или логарифмически преобразованных данных в параметрическом анализе или непараметрическом анализе. Различия в титре нейтрализующих антител против YF на 28-й день, виремии и экспрессии SBREP-1 будут сравниваться между группами плацебо и метформина. Взаимосвязь между системными симптомами, молекулярными коррелятами иммуногенности, виремией, титром антител и метформином будет изучаться методами регрессии. Различия в фоновых характеристиках между субъектами, у которых есть и не имеют начала системных симптомов, будут включены в анализ с поправкой на ковариацию.

Определение уровня исследуемого лекарственного средства в крови: Уровни исследуемого лекарственного средства будут измеряться методом жидкостной хроматографии и тандемной масс-спектрометрии (ЖХ-МС/МС). Анализ будет проводиться на системе ЖХ-МС/МС Shimadzu 8060, которая доступна в больнице общего профиля Сингапура.

Исследования экспрессии генов: Экспрессия генов в цельной крови будет проводиться с использованием анализа Nanostring nCounter. Этот анализ обеспечивает мультиплексный подход для идентификации генов, которые исследователь ранее использовал для проверки совпадений с микрочипом, которые идентифицировали адаптивный стресс ER как фактор восприимчивости к симптоматической инфекции YF17D (см. предварительные данные). Важно отметить, что исследователь работал с Nanostring над созданием полного набора зондов, способных напрямую определять количество транскриптов мРНК в путях стресса ER и цикле TCA, которые будут генами-мишенями в этом испытании. Этот подход также выбран из-за бюджетных ограничений CSA. Тем не менее исследовательская группа соберет дополнительные клинические образцы в качестве резерва и изучит использование RNAseq для изучения фармакогеномики метформина за счет дополнительного финансирования из других источников грантов.

Это предлагаемое исследование экспрессии генов будет проводиться в Центре вирусных исследований и экспериментальной медицины @ SingHealth Duke-NUS (ViREMiCS). ViREMiCS был создан PI и соавтором Энгом Эонгом Оои в качестве исследовательского центра в рамках партнерства SingHealth Duke-NUS Academic Medicine Center. Он создал набор инструментов молекулярной и системной биологии для поддержки и ускорения клинических испытаний, подтверждающих концепцию. Таким образом, исследователи не ожидают каких-либо проблем при использовании этого подхода для измерения экспрессии генов в образцах крови.

Протеомика и метаболомное профилирование: Метаболомика плазмы будет исследована с использованием капиллярного электрофореза/масс-спектрометрии (КЭ/МС) и жидкостной хроматографии/масс-спектрометрии ЖХ-МС/МС, как мы ранее использовали для измерения полярных метаболитов в результате гликолиза и цикла ТХУ [18]. , 25]. Протеомика будет измеряться с помощью ЖХ-МС/МС. Эти анализы будут проводиться с использованием основного оборудования, доступного в Программе новых инфекционных заболеваний и в Центре метаболомики, оба в Duke-NUS. Это позволит использовать мультиомический подход для поддержки расширенных биологических знаний.

Хемокины и цитокины: Уровни хемокинов и цитокинов в сыворотке будут измеряться с использованием анализа Luminex или Olink, который позволяет одновременно измерять более 40 хемокинов и цитокинов в сыворотке.

Титры виремии ЖЛ и PRNT: Нагрузки виремии ЖЛ будут оцениваться с помощью количественной ПЦР в реальном времени (qRT-PCR). Титры нейтрализующих антител против YF будут измеряться с помощью теста нейтрализации уменьшения бляшек (PRNT). Вкратце, 50 БОЕ (бляшкообразующие единицы) вируса YF17D инкубируют с 2-кратными серийными разведениями сыворотки человека в течение одного часа при 37°C, а затем добавляют к монослою клеток Vero в 24-луночных планшетах. Через час среду отсасывают и клетки покрывают 1% карбоксиметилцеллюлозой в поддерживающей среде. Через 5 дней клетки фиксируют, промывают и окрашивают кристаллическим фиолетовым. Количество бляшек будет подсчитано, и титры PRNT50 будут определены с использованием сигмовидной кривой зависимости доза-реакция в качестве обратных величин.

scRNA-seq и исследования Т-клеток: Секвенирование одноклеточной РНК (scRNA-seq) будет проводиться на РВМС, выделенных до и после лечения метформином, чтобы определить влияние лечения метформином на различные субпопуляции иммунных клеток. Это предлагаемое исследование будет проводиться в сотрудничестве с Центром биологии генома Университета Герцога. Впоследствии, используя результаты scRNA-seq в качестве ориентира, мы затем оценим функцию и активность Т-клеток, используя либо проточную цитометрию, либо анализ фермент-связанных иммунных абсорбентов (ELISPOT). Эти анализы будут проводиться с использованием основного оборудования, доступного в рамках Программы новых инфекционных заболеваний в Duke-NUS.