Moduleer cellulaire stress in de immuuncellen om de snelheid van symptomatische virale infectie te verminderen

Criteria voor werving en wervingsproces: proefpersonen worden geworven uit de SingHealth Investigational Medicine Unit (IMU) gezonde vrijwilligersdatabase en wervingsposters. Proefpersonen krijgen een kopie van de deelnemersinformatie en het geïnformeerde toestemmingsformulier om bij aankomst te lezen. De onderzoeker zal een briefingsessie houden over het onderzoek. Daarna worden proefpersonen naar een privékamer geleid waar geïnformeerde toestemming wordt verkregen en waar vragen over het onderzoek vrij kunnen worden gesteld. Proefpersonen zullen niet overhaast beslissen om deel te nemen aan het onderzoek. Ze zullen worden aangemoedigd om met hun familieleden te praten over deelname aan het onderzoek; en mochten hun beslissing (zonder enig vooroordeel) om deel te nemen uitstellen tot na overleg met hun familieleden.

Screeningsbezoeken en -procedures: proefpersonen worden geworven via de SingHealth Investigational Medicine Unit (IMU). Geïnformeerde schriftelijke toestemming zal worden verkregen voordat enige studiegerelateerde procedure of beoordeling wordt uitgevoerd. Tijdens het screeningsbezoek moet worden beoordeeld of alle proefpersonen in aanmerking komen voor rekrutering voor het onderzoek. Proefpersonen moeten voldoen aan alle in- en uitsluitingscriteria die worden beschreven in respectievelijk paragraaf 3.3 en paragraaf 3.4 om in aanmerking te komen voor deelname aan het onderzoek. Geschiktheidscriteria moeten vóór toediening worden bevestigd. Alle klinische laboratoriumtests die zijn gepland voor screening zullen worden verzameld om de pre-dosis basislijn vast te stellen. Andere procedures die moeten worden voltooid voordat het onderzoek begint, zijn onder meer een volledig lichamelijk onderzoek en een urinezwangerschapstest (voor vrouwelijke proefpersonen in de vruchtbare leeftijd).

Studiebezoeken en procedures: Alle in aanmerking komende proefpersonen gaan door naar dag 1, waar ze 1:1 worden gerandomiseerd naar metformine 1000 mg of placebo tweemaal daags gedurende 7 opeenvolgende dagen (dag 1-7). Op dag 4 krijgen de proefpersonen één dosis YF17D toegediend vóór de dosering van het onderzoeksgeneesmiddel. Proefpersonen rapporteren aan de SingHealth IMU op dag 1 (geneesmiddel vóór studie), dag 4 (pre-YF17D), dag 5, 7, 11, 14, 18 (alleen voor deelnemers die toestemming geven voor scRNA-seq- en T-celonderzoeken ) en dag 32 voor onderzoeksbloedafname. Het schema voor bloedafnames zal voor alle studiegroepen identiek zijn. Alle onderzoeksbloedmonsters worden bewaard bij -80oC totdat de werving is voltooid voordat de analyse wordt uitgevoerd. Werving van proefpersonen en bloedafname zullen worden uitgevoerd als een poliklinische studie in de SingHealth Investigational Medicine Unit (IMU), een speciale faciliteit voor klinisch onderzoek in de vroege fase. Op basis van onze eerdere ervaring verwachten we dat we geen moeite zullen hebben om het vereiste aantal deelnemers voor ons onderzoek te rekruteren dat nodig is om aan onze beoogde steekproefomvang te voldoen.

Follow-up en procedures na de studie: Er is geen vereiste voor follow-up of procedures na de studie.

Veiligheidsmonitoringplan: Het onderzoek kan worden geëvalueerd door overheidsinspecteurs/regelgevende instanties die toegang moeten krijgen tot e-CRF's, brondocumenten en andere onderzoeksbestanden. De inspecteurs zullen CRF's beoordelen en vergelijken met brondocumenten om de nauwkeurige en volledige verzameling van gegevens te verifiëren en te bevestigen dat het onderzoek wordt uitgevoerd volgens het protocol, ICH-Good Clinical Practices (ICH-GCP) en alle toepasselijke regelgeving.

Bekende vaak voorkomende bijwerkingen van metformine zijn diarree, misselijkheid, maagpijn, brandend maagzuur en een opgeblazen gevoel. Zeldzame bijwerkingen zijn melkzuuracidose en hypoglykemie. Het beperken van de duur van de metforminedosering tot 10 dagen zou het risico op deze ernstige bijwerkingen verder verminderen. Proefpersonen zullen worden getraind om te letten op vroege symptomen die verband houden met deze AE's en om onmiddellijk te rapporteren aan de IMU als ze een van deze symptomen ervaren. Details van de terminologie van AE-gebeurtenissen, datum en tijd van het begin en einde van de gebeurtenis, de ernst, het gebruik van de CTCAE of de gegeven behandeling, de impact op het werk en op de voortzetting van het onderzoek, en het uiteindelijke resultaat van de gebeurtenis zullen worden vastgelegd in het casusrapport tot de oplossing van de gebeurtenis.

Tijdens het onderzoek zal de onderzoeker de proefpersonen rekruteren, een volledige anamnese en lichamelijk onderzoek uitvoeren bij zowel geplande als ongeplande bezoeken. De onderzoeker zal ook de dagboeken van de proefpersoon bekijken op mogelijke bijwerkingen en de bijwerkingen behandelen op basis van de beste klinische praktijk, mochten deze zich voordoen. Naleving van het onderzoeksprotocol zal worden gecontroleerd door het nemen van een medicatiegeschiedenis en het aantal pillen en inspectie van het dagboek, evenals meting van het metformine-geneesmiddelniveau op specifieke tijdstippen.

Gegevenskwaliteitsborging: De PI en Co-I's zullen het onderzoek periodiek beoordelen op gegevens- en veiligheidsmonitoring. Interne kwaliteitscontroles zullen worden uitgevoerd door twee CRC's die lid zijn van het onderzoeksteam. De gegevens die door het ene CRC worden ingevoerd, worden door een ander gecontroleerd aan de hand van de brondocumenten. Het onderzoek kan ook worden uitgekozen voor monitoring door SingHealth Office of Research Integrity and Compliance (ORIC) of worden beoordeeld door overheidsinspecteurs/regelgevende instanties die toegang moeten krijgen tot e-CRF's, brondocumenten en andere onderzoeksbestanden. De monitors/inspecteurs kunnen CRF's beoordelen en vergelijken met brondocumenten om de nauwkeurige en volledige verzameling van gegevens te verifiëren en te bevestigen dat het onderzoek wordt uitgevoerd volgens het protocol, ICH-Good Clinical Practices (ICH-GCP) en alle toepasselijke regelgeving.

Gegevensinvoer en -opslag: Alle gegevens van de deelnemer worden bij aanwerving geanonimiseerd. Papieren formulieren voor het verzamelen van onderzoeksgegevens, zoals CRF's, logs en dagboeken, worden bewaard in de Investigator's Site File en achter slot en grendel opgeslagen in SingHealth IMU, alleen toegankelijk voor gedelegeerde onderzoeksteamleden. Directe gegevensvastlegging van demografische en klinische gegevens zal worden vastgelegd op brondocumenten. Identificatiegegevens worden in een apart bestand in een ander kantoor bewaard en er wordt alles aan gedaan om de privacy van de deelnemers te beschermen. De te analyseren gegevens bevatten alleen geanonimiseerde gegevens. Er zal gebruik worden gemaakt van een elektronisch gegevensregistratiesysteem. Alle elektronische gegevens zijn beveiligd met een wachtwoord en zijn alleen toegankelijk voor leden van het onderzoeksteam. Specimens, testresultaten of pathogeengegevens worden in het Duke-NUS EID-laboratorium opgeslagen op een stand-alone pc waarbij de toegang met een wachtwoord is beveiligd.

Bepaling van de steekproefomvang: Een steekproefomvang van 20 per arm geeft 80% power om een ​​vermindering van de systemische symptomen te detecteren van 50% naar 10% (risicoverschil = 0,4 reductieratio = 0,8) bij deelnemers die placebo kregen versus degenen die pre- behandeld met metformine versus placebogroep met een 2-zijdig 5% type I foutenpercentage (PASS 13 Software). Rekening houdend met een potentieel uitvalpercentage van 10%, is de totale steekproefomvang in totaal 44 (22 per arm). Uit onze eerdere ervaring met de werving van proefpersonen in de YF-vaccinstudie blijkt dat er geen uitvallers waren tijdens de follow-upperiode van 1 maand. Daarom zijn we ervan overtuigd dat we het vereiste aantal proefpersonen binnen de proefperiode kunnen werven.

Statistische analyse: Fisher's exact-test zal worden gebruikt om het verschil in systemische symptoomfrequentie tussen de placebo-arm en de metformine-voorbehandelingsarm te beoordelen. Betrouwbaarheidsintervallen (CI) voor AE-frequenties worden geschat met behulp van de exacte methode. BI voor risicoverschil zal worden geschat met behulp van de scoremethode van Newcombe.

Diagnostische grafieken zullen worden gebruikt om de keuze te bepalen van het gebruik van de onbewerkte gegevens of log-getransformeerde gegevens in parametrische analyses of niet-parametrische analyses. Verschillen in anti-YF-neutraliserende antilichaamtiter op dag 28, viremie en SBREP-1-expressie zullen worden vergeleken tussen placebo- en metforminegroepen. De relatie tussen systemische symptomen, moleculaire correlaten van immunogeniciteit, viremie, antilichaamtiter en metformine zal onderzocht worden met regressiemethoden. Verschillen in achtergrondkenmerken tussen proefpersonen die wel en geen systemische symptomen hebben, zullen worden opgenomen in voor covariaten aangepaste analyse.

Bepaling van het bloedniveau van het onderzoeksgeneesmiddel: De niveaus van het onderzoeksgeneesmiddel zullen worden gemeten via een vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometrische (LC-MS/MS) assaymethode. De test zal worden uitgevoerd op een Shimadzu 8060 LC-MS/MS-systeem, dat verkrijgbaar is bij het Singapore General Hospital.

Genexpressiestudies: genexpressie in volbloed zou worden uitgevoerd met behulp van de Nanostring nCounter-assay. Deze test biedt een multiplexbenadering om de genen te identificeren die de onderzoeker eerder heeft gebruikt om de treffers van de microarray te valideren die adaptieve ER-stress identificeerde als een vatbaarheidsfactor voor symptomatische YF17D-infectie (zie voorlopige gegevens). Belangrijk is dat de onderzoeker met Nanostring heeft gewerkt om een ​​uitgebreide set sondes aan te passen die in staat zijn om mRNA-transcripten direct te kwantificeren in de ER-stress- en TCA-cyclusroutes, die de doelgenen in deze proef zouden zijn. Deze benadering is ook gekozen vanwege de budgettaire beperking van de CSA. Desalniettemin zal het onderzoeksteam extra klinische monsters verzamelen als back-up en het gebruik van RNAseq onderzoeken om de farmacogenomica van metformine te ontdekken door middel van aanvullende financiering uit andere subsidiebronnen.

Dit voorgestelde onderzoek naar genexpressie zal worden uitgevoerd in het Viral Research and Experimental Medicine Center @ SingHealth Duke-NUS (ViREMiCS). ViREMiCS is opgericht door de PI en medewerker, Eng Eong Ooi, als een onderzoekscentrum in het SingHealth Duke-NUS Academic Medicine Center-partnerschap. Het heeft een reeks moleculaire en systeembiologische hulpmiddelen ontwikkeld om proof-of-concept klinische proeven te ondersteunen en te versnellen. De onderzoekers verwachten dus geen enkel probleem bij het gebruik van deze aanpak om genexpressie in bloedmonsters te meten.

Proteomics en Metabolomic profilering: Plasma metabolomics zullen worden onderzocht met behulp van capillaire elektroforese/massaspectrometrie (CE/MS) en vloeistofchromatografie/massaspectrometrie LC-MS/MS, zoals we eerder hebben gebruikt om de polaire metabolieten van glycolyse en TCA-cyclus te meten [18 , 25]. Proteomics wordt gemeten met behulp van LC-MS/MS. Deze assays zullen worden uitgevoerd met behulp van de kernapparatuur die beschikbaar is in het Program in Emerging Infectious Diseases en Metabolomics Core Facility, beide in Duke-NUS. Dit zal een multi-omics-benadering mogelijk maken ter ondersteuning van verbeterde biologische inzichten.

Chemokine en cytokine: serumchemokine- en cytokineniveaus zullen worden gemeten met behulp van de Luminex- of Olink-assay waarmee meer dan 40 serumchemokines en cytokines tegelijkertijd kunnen worden gemeten.

YF-viremie- en PRNT-titers: YF-viremiebelastingen zullen worden beoordeeld met behulp van kwantitatieve real-time PCR (qRT-PCR). Anti-YF-neutraliserende antilichaamtiters zullen worden gemeten met een plaquereductie-neutralisatietest (PRNT). In het kort, 50 PFU (plaqueforming units) van het YF17D-virus zullen worden geïncubeerd met 2-voudige seriële verdunningen van humaan serum gedurende één uur bij 37°C, en vervolgens worden toegevoegd aan een monolaag van Vero-cellen in platen met 24 putjes. Een uur later worden de media afgezogen en worden de cellen bedekt met carboxymethylcellulose 1% in onderhoudsmedia. Na 5 dagen worden de cellen gefixeerd, gewassen en gekleurd met kristalviolet. Het aantal plaques wordt geteld en PRNT50-titers worden bepaald met behulp van een sigmoïde dosis-responscurve-fit als reciproke waarden.

scRNA-seq en T-celstudies: Single cell RNA sequencing (scRNA-seq) zal worden uitgevoerd op PBMC's die voor en na behandeling met metformine zijn geïsoleerd om de impact van behandeling met metformine op verschillende subgroepen van immuuncellen te bepalen. Deze voorgestelde studie zal worden uitgevoerd in samenwerking met de Genome Biology Facility van Duke-NUS. Vervolgens zullen we, met behulp van de bevindingen van scRNA-seq als leidraad, de T-celfunctie en -activiteit beoordelen met behulp van flowcytometrie of een enzymgekoppelde immuunabsorberende vlek (ELISPOT) -test. Deze assays zullen worden uitgevoerd met behulp van kernapparatuur die beschikbaar is in het programma voor opkomende infectieziekten in Duke-NUS.