Moduler cellulær stress i immuncellerne for at reducere frekvensen af ​​symptomatisk viral infektion

Kriterier for rekruttering og rekruttering: Emner vil blive rekrutteret fra SingHealth Investigational Medicine Unit (IMU) database med sunde frivillige og rekrutteringsplakater. Emner vil få udleveret en kopi af deltagerinformationen og formularen til informeret samtykke til at læse ved deres ankomst. En orienteringssession om undersøgelsen vil blive gennemført af investigator. Derefter vil forsøgspersoner blive ført ind i et privat rum, hvor informeret samtykke indhentes, og hvor spørgsmål om undersøgelsen frit kan stilles. Forsøgspersonerne vil ikke skynde sig at træffe en beslutning om at deltage i undersøgelsen. De vil blive opfordret til at tale med deres familiemedlemmer om deltagelse i undersøgelsen; og lov til at udsætte deres beslutning (uden nogen fordomme) om at deltage til efter drøftelse med deres familiemedlemmer.

Screeningsbesøg og -procedurer: Emner vil blive rekrutteret via SingHealth Investigational Medicine Unit (IMU). Der vil blive indhentet informeret skriftligt samtykke, før en undersøgelsesrelateret procedure eller vurdering udføres. Alle forsøgspersoners egnethed til rekruttering til undersøgelsen skal vurderes under screeningsbesøget. Forsøgspersoner skal opfylde alle inklusions- og eksklusionskriterier beskrevet i henholdsvis afsnit 3.3 og afsnit 3.4 for at være berettiget til optagelse i undersøgelsen. Berettigelseskriterier skal bekræftes før dosering. Alle kliniske laboratorietests, der er planlagt til screening, vil blive indsamlet for at etablere præ-dosis baseline. Andre procedurer, der skal afsluttes, før undersøgelsen begynder, omfatter en fuldstændig fysisk undersøgelse og uringraviditetstest (for kvindelige forsøgspersoner i den fødedygtige alder).

Studiebesøg og procedurer: Alle kvalificerede forsøgspersoner vil fortsætte til dag 1, hvor de vil blive randomiseret 1:1 til enten metformin 1000mg eller placebo to gange dagligt i 7 på hinanden følgende dage (dage 1-7). På dag 4 vil forsøgspersonerne blive administreret én dosis YF17D før undersøgelseslægemiddeldosering. Forsøgspersoner vil rapportere til SingHealth IMU på dag 1 (præ-studie lægemiddel), dag 4 (præ-YF17D), dag 5, 7, 11, 14, 18 (kun for deltagere, der giver samtykke til scRNA-seq og T-celle studier ) og dag 32 til forskningsblodprøvetagning. Tidsplanen for blodudtagninger vil være identisk for alle undersøgelsesgrupper. Alle forskningsblodprøver vil blive opbevaret ved -80oC, indtil rekruttering er afsluttet før analyse. Emnerekruttering og blodindsamling vil blive udført som et ambulant studie i SingHealth Investigational Medicine Unit (IMU), en dedikeret tidlig fase klinisk forsøgsfacilitet. Ud fra vores tidligere erfaring forventer vi, at vi ikke vil have problemer med at rekruttere det nødvendige antal deltagere til vores undersøgelse, der er nødvendige for at nå vores målstikprøvestørrelse.

Opfølgning og procedurer efter undersøgelse: Der er ingen krav om opfølgning eller procedurer efter undersøgelsen.

Sikkerhedsovervågningsplan: Undersøgelsen kan evalueres af offentlige inspektører/tilsynsmyndigheder, som skal have adgang til e-CRF'er, kildedokumenter og andre undersøgelsesfiler. Inspektørerne vil gennemgå CRF'er og sammenligne dem med kildedokumenter for at verificere nøjagtig og fuldstændig indsamling af data og bekræfte, at undersøgelsen udføres i overensstemmelse med protokollen, ICH-Good Clinical Practices (ICH-GCP) og alle gældende regler.

Kendte almindelige bivirkninger af metformin omfatter diarré, kvalme, mavesmerter, halsbrand og oppustethed. Sjældne bivirkninger omfatter laktatacidose og hypoglykæmi. Begrænsning af varigheden af ​​metformindosis til 10 dage vil yderligere reducere risikoen for disse alvorlige bivirkninger. Forsøgspersonerne vil blive trænet i at holde øje med tidlige symptomer forbundet med disse AE'er og straks at rapportere til IMU, hvis de oplever nogen af ​​disse symptomer. Detaljer om AE-hændelsesterminologi, dato og klokkeslæt for hændelsens start og afslutning, sværhedsgrad, brug af CTCAE eller behandling, indvirkning på arbejdet og for fortsættelsen af ​​undersøgelsen og det endelige resultat af hændelsen vil blive registreret på case-rapporten indtil løsning af begivenheden.

Under undersøgelsen vil investigator rekruttere forsøgspersonerne, samt udføre fuld historieoptagelse og fysisk undersøgelse ved både planlagte og uplanlagte besøg. Efterforskeren vil også gennemgå forsøgspersonens dagbøger for eventuelle bivirkninger og håndtere bivirkningerne baseret på bedste kliniske praksis, hvis de skulle opstå. Overholdelse af undersøgelsesprotokol vil blive kontrolleret ved at tage en medicinhistorie og pilleantal og inspektion af dagbog samt måling af metformin-lægemiddelniveau på bestemte tidspunkter.

Datakvalitetssikring: PI'erne og co-I'erne vil regelmæssigt gennemgå undersøgelsen med henblik på data- og sikkerhedsovervågning. Interne kvalitetstjek vil blive udført af to CRC'er, som er medlemmer af undersøgelsesteamet. De data, der indtastes af en CRC, vil blive kontrolleret af en anden ved hjælp af kildedokumenterne. Undersøgelsen kan også vælges til overvågning af SingHealth Office of Research Integrity and Compliance (ORIC) eller evalueres af offentlige inspektører/regulerende myndigheder, som skal have adgang til e-CRF'er, kildedokumenter og andre undersøgelsesfiler. Monitorerne/inspektørerne kan gennemgå CRF'er og sammenligne dem med kildedokumenter for at verificere nøjagtig og fuldstændig indsamling af data og bekræfte, at undersøgelsen udføres i overensstemmelse med protokollen, ICH-Good Clinical Practices (ICH-GCP) og alle gældende regler.

Dataindtastning og lagring: Alle deltagers data vil blive afidentificeret ved rekruttering. Papirkopierede forskningsdataindsamlingsformularer såsom CRF'er, logfiler og dagbøger vil blive opbevaret i Investigator's Site File og opbevaret i SingHealth IMU under lås og slå, kun tilgængeligt for delegerede undersøgelsesteammedlemmer. Direkte datafangst af demografiske og kliniske data vil blive fanget på kildedokumenter. Identifikatorer vil blive opbevaret i en separat fil på et andet kontor, og der vil blive gjort alt for at beskytte deltagernes privatliv. De data, der skal analyseres, vil kun indeholde afidentificerede data. Der vil blive brugt et elektronisk datafangstsystem. Alle elektroniske data vil være beskyttet med adgangskode og kan kun tilgås af undersøgelsesteammedlemmer. Prøver, testresultater eller patogendata vil blive opbevaret på Duke-NUS EID-laboratorium i en selvstændig pc, hvorved adgangen er beskyttet med adgangskode.

Bestemmelse af prøvestørrelse: En prøvestørrelse på 20 pr. arm vil give 80 % kraft til at påvise en reduktion i systemiske symptomer fra 50 % til 10 % (risikoforskel = 0,4 reduktionsratio = 0,8) hos deltagere, der får placebo versus præ- behandlet med metformin versus placebogruppen med en 2-sidet 5 % type I fejlrate (PASS 13 Software). Tager man en potentiel frafaldsrate på 10 % i betragtning, er den samlede stikprøvestørrelse 44 i alt (22 pr. arm). Fra vores tidligere erfaring med rekruttering af forsøgspersoner i YF-vaccineforsøget var der ingen frafald i den 1-måneds opfølgningsperiode. Derfor er vi sikre på, at vi kan rekruttere det nødvendige antal forsøgspersoner inden for prøveperioden.

Statistisk analyse: Fishers eksakte test vil blive brugt til at vurdere forskellen i systemisk symptomfrekvens mellem placebo og metformin før-behandlingsarm. Konfidensintervaller (CI) for AE-rater vil blive estimeret ved hjælp af den nøjagtige metode. CI for risikoforskel vil blive estimeret ved hjælp af Newcombes scoremetode.

Diagnostiske plots vil blive brugt til at bestemme valget mellem at bruge rådata eller log-transformerede data i parametriske analyser eller ikke-parametriske analyser. Forskelle i anti-YF-neutraliserende antistoftiter på dag 28, viræmi og SBREP-1-ekspression vil blive sammenlignet mellem placebo- og metformingrupper. Forholdet mellem systemiske symptomer, molekylære korrelater af immunogenicitet, viræmi, antistoftiter og metformin vil blive udforsket med regressionsmetoder. Forskelle i baggrundskarakteristika mellem forsøgspersoner, der har og ikke har systemisk symptomdebut, vil blive inkluderet i kovariatjusteret analyse.

Bestemmelse af undersøgelseslægemiddelniveau i blodet: Studielægemiddelniveauer vil blive målt ved hjælp af en væskekromatografi-tandem massespektrometrisk (LC-MS/MS) analysemetode. Analysen vil blive udført på et Shimadzu 8060 LC-MS/MS-system, som er tilgængeligt på Singapore General Hospital.

Genekspressionsundersøgelser: Genekspression i fuldblod ville blive udført ved hjælp af Nanostring nCounter-assay. Denne analyse giver en multipleks tilgang til at identificere de gener, som efterforskeren tidligere har brugt til at validere hits fra mikroarrayet, der identificerede adaptiv ER-stress som en modtagelighedsfaktor for symptomatisk YF17D-infektion (se foreløbige data). Det er vigtigt, at efterforskeren har arbejdet med Nanostring for at tilpasse et omfattende sæt af prober, der er i stand til direkte at kvantificere mRNA-transkripter i ER-stress- og TCA-cyklusvejene, som ville være målgenerne i dette forsøg. Denne tilgang er også valgt på grund af CSA's budgetbegrænsning. Ikke desto mindre vil undersøgelsesholdet indsamle ekstra kliniske prøver som backup og udforske brugen af ​​RNAseq til at opdage farmakogenomikken af ​​metformin gennem yderligere finansiering fra andre tilskudskilder.

Denne foreslåede genekspressionsundersøgelse vil blive udført på Viral Research and Experimental Medicine Center @ SingHealth Duke-NUS (ViREMiCS). ViREMiCS blev etableret af PI og samarbejdspartner Eng Eong Ooi som et forskningscenter i SingHealth Duke-NUS Academic Medicine Center-partnerskabet. Det har etableret en række molekylære og systembiologiske værktøjer til at understøtte og fremskynde proof-of-concept kliniske forsøg. Forskerne forventer således ikke noget problem ved at bruge denne tilgang til at måle genekspression i blodprøver.

Proteomics og metabolomic profiling: Plasma metabolomics vil blive undersøgt ved hjælp af kapillær elektroforese/massespektrometri (CE/MS), og væskekromatografi/massespektrometri LC-MS/MS, som vi tidligere har brugt til at måle de polære metabolitter fra glykolyse og TCA cyklus [18 , 25]. Proteomics vil blive målt ved hjælp af LC-MS/MS. Disse analyser vil blive udført ved hjælp af det kerneudstyr, der er tilgængeligt i programmet for nye infektionssygdomme og metabolomics Core Facility, begge i Duke-NUS. Dette vil muliggøre en multi-omics tilgang til at understøtte forbedret biologisk indsigt.

Kemokin og cytokin: Serumkemokin- og cytokinniveauer vil blive målt ved hjælp af Luminex- eller Olink-analysen, der gør det muligt at måle mere end 40 serumkemokiner og -cytokiner samtidigt.

YF Viremia og PRNT titre: YF viremia belastninger vil blive vurderet ved hjælp af kvantitativ real-time PCR (qRT-PCR). Anti-YF neutraliserende antistoftitre vil blive målt ved plakreduktionsneutraliseringstest (PRNT). Kort fortalt vil 50 PFU (plaque-dannende enheder) YF17D-virus blive inkuberet med 2-fold serielle fortyndinger af humant serum i en time ved 37oC og derefter tilsat til et monolag af Vero-celler i 24-brønds plader. En time senere vil medier blive aspireret og celler overlejret med carboxymethylcellulose 1% i vedligeholdelsesmedier. Efter 5 dage vil cellerne blive fikseret, vasket og farvet med krystalviolet. Antallet af plaques tælles, og PRNT50-titre bestemmes ved hjælp af en sigmoid dosis-respons-kurvetilpasning som gensidige værdier.

scRNA-seq- og T-celleundersøgelser: Enkeltcelle-RNA-sekventering (scRNA-seq) vil blive udført på PBMC'er isoleret før og efter metforminbehandling for at bestemme virkningen af ​​metforminbehandling på forskellige immuncelleundergrupper. Denne foreslåede undersøgelse vil blive udført i samarbejde med Genome Biology Facility på Duke-NUS. Efterfølgende, ved at bruge resultaterne af scRNA-seq som en guide, vil vi derefter vurdere T-cellefunktion og aktivitet ved hjælp af enten flowcytometri eller enzym-linked immune absorbent spot (ELISPOT) assay. Disse analyser vil blive udført ved hjælp af kerneudstyr tilgængeligt i programmet for nye infektionssygdomme i Duke-NUS.