Moduler cellulær stress i immuncellene for å redusere frekvensen av symptomatisk virusinfeksjon

Kriterier for rekrutterings- og rekrutteringsprosess: Emner vil bli rekruttert fra SingHealth Investigational Medicine Unit (IMU) database for sunne frivillige og rekrutteringsplakater. Emner vil få en kopi av deltakerinformasjonen og informert samtykkeskjema for å lese ved ankomst. En orienteringssesjon om studien vil bli gjennomført av etterforskeren. Deretter vil forsøkspersonene bli ført inn i et privat rom hvor informert samtykke innhentes og hvor spørsmål om studien kan stilles fritt. Forsøkspersonene vil ikke bli forhastet til å ta en beslutning om å delta i studien. De vil bli oppfordret til å snakke med familiemedlemmer om deltakelse i studien; og tillatelse til å utsette avgjørelsen (uten fordommer) om å delta til etter diskusjon med familiemedlemmer.

Screeningbesøk og prosedyrer: Emner vil bli rekruttert via SingHealth Investigational Medicine Unit (IMU). Informert skriftlig samtykke vil bli innhentet før en studierelatert prosedyre eller vurdering utføres. Alle forsøkspersoners kvalifikasjoner for rekruttering til studien må vurderes under screeningbesøk. Forsøkspersoner må tilfredsstille alle inklusjons- og eksklusjonskriterier som er skissert i henholdsvis seksjon 3.3 og seksjon 3.4 for å være kvalifisert for opptak til studiet. Kvalifikasjonskriterier må bekreftes før dosering. Alle kliniske laboratorietester som er planlagt for screening vil bli samlet inn for å etablere pre-dose baseline. Andre prosedyrer som må fullføres før studien starter inkluderer en fullstendig fysisk undersøkelse og uringraviditetstest (for kvinnelige forsøkspersoner i fertil alder).

Studiebesøk og prosedyrer: Alle kvalifiserte forsøkspersoner vil fortsette til dag 1, hvor de vil bli randomisert 1:1 til enten metformin 1000mg eller placebo to ganger daglig i 7 påfølgende dager (dager 1-7). På dag 4 vil forsøkspersonene få administrert én dose YF17D før studiemedikamentdosering. Forsøkspersonene vil rapportere til SingHealth IMU på dag 1 (medikament før studie), dag 4 (pre-YF17D), dag 5, 7, 11, 14, 18 (kun for deltakere som samtykker til scRNA-seq og T-cellestudier ) og dag 32 for forskningsblodprøvetaking. Tidsplanen for blodprøvetaking vil være identisk for alle studiegruppene. Alle forskningsblodprøver vil bli lagret ved -80oC inntil rekruttering er fullført før analyse. Emnerekruttering og blodinnsamling vil bli utført som en poliklinisk studie i SingHealth Investigational Medicine Unit (IMU), et dedikert tidlig fase klinisk utprøvingsanlegg. Fra vår tidligere erfaring regner vi med at vi ikke vil ha problemer med å rekruttere det nødvendige antallet deltakere til studien vår som er nødvendig for å nå målutvalget vårt.

Oppfølging og prosedyrer etter studie: Det er ingen krav om oppfølging eller prosedyrer etter studien.

Plan for sikkerhetsovervåking: Studien kan evalueres av offentlige inspektører/reguleringsmyndigheter som må få tilgang til e-CRF-er, kildedokumenter og andre studiefiler. Inspektørene vil gjennomgå CRF-er og sammenligne dem med kildedokumenter for å bekrefte nøyaktig og fullstendig innsamling av data og bekrefte at studien utføres i henhold til protokollen, ICH-Good Clinical Practices (ICH-GCP) og alle gjeldende forskrifter.

Kjente vanlige bivirkninger av metformin inkluderer diaré, kvalme, magesmerter, halsbrann og oppblåsthet. Sjeldne bivirkninger inkluderer laktacidose og hypoglykemi. Å begrense varigheten av metformindoseringen til 10 dager vil ytterligere redusere risikoen for disse alvorlige bivirkningene. Forsøkspersonene vil bli opplært til å se etter tidlige symptomer assosiert med disse bivirkningene og å rapportere til IMU umiddelbart dersom de opplever noen av disse symptomene. Detaljer om terminologi for AE-hendelse, dato og klokkeslett for hendelsens start og slutt, alvorlighetsgrad, bruk av CTCAE eller gitt behandling, innvirkning på arbeidet og fortsettelsen av studien, og endelig utfall av hendelsen vil bli registrert på saksrapporten frem til løsning av arrangementet.

Under studien vil etterforskeren rekruttere forsøkspersonene, samt utføre full historietaking og fysisk undersøkelse ved både planlagte og uplanlagte besøk. Utforskeren vil også gjennomgå forsøkspersonens dagbøker for potensielle bivirkninger og håndtere bivirkningene basert på beste kliniske praksis dersom de skulle oppstå. Overholdelse av studieprotokollen vil bli sjekket ved å ta en medisinhistorie, og antall piller og inspeksjon av dagbok samt måling av metformin medikamentnivå på bestemte tidspunkter.

Datakvalitetssikring: PI og co-Is vil gjennomgå studien med jevne mellomrom for data- og sikkerhetsovervåking. Interne kvalitetskontroller vil bli utført av to CRC-er som er studieteammedlemmer. Dataene som legges inn av en CRC vil bli kontrollert av en annen ved å bruke kildedokumentene. Studien kan også velges for overvåking av SingHealth Office of Research Integrity and Compliance (ORIC) eller evaluert av offentlige inspektører/regulatoriske myndigheter som må få tilgang til e-CRF-er, kildedokumenter og andre studiefiler. Monitorene/inspektørene kan gjennomgå CRF-er og sammenligne dem med kildedokumenter for å bekrefte nøyaktig og fullstendig innsamling av data og bekrefte at studien utføres i henhold til protokollen, ICH-Good Clinical Practices (ICH-GCP) og alle gjeldende forskrifter.

Dataregistrering og lagring: Alle deltakers data vil bli avidentifisert ved rekruttering. Papirbaserte forskningsdatainnsamlingsskjemaer som CRF-er, logger og dagbøker vil bli oppbevart i Investigator's Site File og lagret i SingHealth IMU under lås og nøkkel, kun tilgjengelig for delegerte studieteammedlemmer. Direkte datafangst av demografiske og kliniske data vil bli fanget opp på kildedokumenter. Identifikatorer vil bli oppbevart i en egen fil på et annet kontor, og det vil bli gjort alt for å beskytte deltakernes personvern. Dataene som skal analyseres vil kun inneholde avidentifiserte data. Det vil bli brukt et elektronisk datafangstsystem. Alle elektroniske data vil være passordbeskyttet og kan bare nås av studieteammedlemmer. Prøver, testresultater eller patogendata vil bli lagret på Duke-NUS EID-laboratoriet på en frittstående PC der tilgangen er passordbeskyttet.

Bestemmelse av prøvestørrelse: En prøvestørrelse på 20 per arm vil gi 80 % kraft til å oppdage en reduksjon i systemiske symptomer fra 50 % til 10 % (risikoforskjell = 0,4 reduksjonsratio = 0,8) hos deltakere som får placebo versus som er pre- behandlet med metformin versus placebogruppe med en 2-sidig 5 % type I feilrate (PASS 13 programvare). Tar man med en potensiell frafallsrate på 10 %, er den totale prøvestørrelsen totalt 44 (22 per arm). Fra vår tidligere erfaring med rekruttering av fag i YF-vaksinestudien, var det ingen frafall i løpet av 1-måneds oppfølgingsperioden. Derfor er vi sikre på at vi kan rekruttere det nødvendige antallet forsøkspersoner innenfor prøveperioden.

Statistisk analyse: Fishers eksakte test vil bli brukt for å vurdere forskjellen i systemisk symptomfrekvens mellom placebo og metformin før-behandlingsarm. Konfidensintervaller (CI) for AE-rater vil bli estimert ved å bruke den eksakte metoden. CI for risikoforskjell vil bli estimert ved hjelp av Newcombes skåremetode.

Diagnostiske plott vil bli brukt for å bestemme valget mellom å bruke rådata eller log-transformerte data i parametriske analyser eller ikke-parametriske analyser. Forskjeller i anti-YF-nøytraliserende antistofftiter på dag 28, viremi og SBREP-1-ekspresjon vil bli sammenlignet mellom placebo- og metformingruppene. Sammenhengen mellom systemiske symptomer, molekylære korrelater av immunogenisitet, viremi, antistofftiter og metformin vil bli utforsket med regresjonsmetoder. Forskjeller i bakgrunnskarakteristikker mellom forsøkspersoner som har og ikke har systemisk symptomdebut vil inkluderes i kovariatjustert analyse.

Bestemmelse av studiemedikamentets blodnivå: Studiemedikamentnivåer vil bli målt via en væskekromatografi-tandem massespektrometrisk (LC-MS/MS) analysemetode. Analysen vil bli utført på et Shimadzu 8060 LC-MS/MS-system, som er tilgjengelig på Singapore General Hospital.

Genekspresjonsstudier: Genekspresjon i fullblod vil bli utført ved bruk av Nanostring nCounter-analyse. Denne analysen gir en multipleks tilnærming for å identifisere genene som etterforskeren tidligere har brukt for å validere treffene fra mikroarrayen som identifiserte adaptivt ER-stress som en mottakelighetsfaktor for symptomatisk YF17D-infeksjon (se foreløpige data). Viktigere, etterforskeren har jobbet med Nanostring, for å tilpasse et omfattende sett med prober som er i stand til direkte å kvantifisere mRNA-transkripsjoner i ER-stress- og TCA-syklusveiene, som ville være målgenene i denne studien. Denne tilnærmingen er også valgt på grunn av CSA-budsjettbegrensningen. Ikke desto mindre vil studieteamet samle inn ekstra kliniske prøver som backup og utforske bruken av RNAseq for å oppdage farmakogenomikken til metformin gjennom ytterligere finansiering fra andre bevilgningskilder.

Denne foreslåtte genekspresjonsstudien vil bli utført ved Viral Research and Experimental Medicine Center @ SingHealth Duke-NUS (ViREMiCS). ViREMiCS ble etablert av PI og samarbeidspartner, Eng Eong Ooi, som et forskningssenter i partnerskapet SingHealth Duke-NUS Academic Medicine Center. Den har etablert en pakke med molekylær- og systembiologiske verktøy for å støtte og akselerere proof-of-consept kliniske studier. Etterforskerne forventer derfor ikke noe problem med å bruke denne tilnærmingen til å måle genuttrykk i blodprøver.

Proteomikk og metabolomisk profilering: Plasmametabolomikk vil bli undersøkt ved bruk av kapillærelektroforese/massespektrometri (CE/MS), og væskekromatografi/massespektrometri LC-MS/MS som vi tidligere har brukt for å måle de polare metabolittene fra glykolyse og TCA-syklus [18 , 25]. Proteomikk vil bli målt ved hjelp av LC-MS/MS. Disse analysene vil bli utført ved å bruke kjerneutstyret som er tilgjengelig i Program in Emerging Infectious Diseases and Metabolomics Core Facility, begge i Duke-NUS. Dette vil muliggjøre en multi-omics-tilnærming for å støtte forbedret biologisk innsikt.

Kjemokin og cytokin: Serumkjemokin- og cytokinnivåer vil bli målt ved hjelp av Luminex- eller Olink-analysen som gjør det mulig å måle mer enn 40 serumkjemokiner og cytokiner samtidig.

YF-viremi- og PRNT-titere: YF-viremia-belastninger vil bli vurdert ved bruk av kvantitativ sanntids-PCR (qRT-PCR). Anti-YF-nøytraliserende antistofftitere vil bli målt med plakkreduksjonsnøytraliseringstest (PRNT). Kort fortalt vil 50 PFU (plakkdannende enheter) av YF17D-virus bli inkubert med 2-gangers seriefortynninger av humant serum i én time ved 37oC, og deretter tilsatt et monolag av Vero-celler i 24-brønners plater. En time senere vil media bli aspirert og cellene dekket med karboksymetylcellulose 1 % i vedlikeholdsmedier. Etter 5 dager vil cellene fikseres, vaskes og farges med krystallfiolett. Antall plakk vil bli talt og PRNT50-titere bestemt ved bruk av en sigmoid dose-responskurvetilpasning som gjensidige verdier.

scRNA-seq og T-cellestudier: Enkeltcelle RNA-sekvensering (scRNA-seq) vil bli utført på PBMC-er isolert før og etter metforminbehandling for å bestemme virkningen av metforminbehandling på ulike immuncelleundergrupper. Denne foreslåtte studien vil bli utført i samarbeid med Genome Biology Facility ved Duke-NUS. Deretter, ved å bruke funnene til scRNA-seq som en guide, vil vi deretter vurdere T-cellefunksjon og aktivitet ved å bruke enten flowcytometri eller enzymkoblet immunabsorberende punkt (ELISPOT) assay. Disse analysene vil bli utført ved hjelp av kjerneutstyr tilgjengelig i programmet for nye infeksjonssykdommer i Duke-NUS.