Modulujte buněčný stres v imunitních buňkách, abyste snížili míru symptomatické virové infekce

Kritéria pro nábor a proces náboru: Subjekty budou rekrutovány z databáze zdravých dobrovolníků SingHealth Investigational Medicine Unit (IMU) a náborových plakátů. Subjekty obdrží kopii formuláře s informacemi o účastníkovi a informovaného souhlasu k přečtení po příjezdu. Zkoušející provede informační schůzku o studii. Poté budou subjekty uvedeny do soukromé místnosti, kde je získán informovaný souhlas a kde mohou být volně kladeny otázky týkající se studie. Subjekty nebudou spěchat do rozhodování o účasti ve studii. Budou vyzváni, aby o účasti ve studii hovořili se svými rodinnými příslušníky; a bylo jim dovoleno odložit své rozhodnutí (bez jakýchkoli předsudků) zúčastnit se až po diskusi se svými rodinnými příslušníky.

Screeningové návštěvy a postupy: Subjekty budou přijímány prostřednictvím SingHealth Investigational Medicine Unit (IMU). Před provedením jakéhokoli postupu nebo hodnocení souvisejícího se studií bude získán informovaný písemný souhlas. Během screeningové návštěvy musí být posouzena způsobilost všech subjektů pro nábor do studie. Subjekty musí splňovat všechna kritéria pro zařazení a vyloučení uvedená v části 3.3, respektive v části 3.4, aby byli způsobilí pro zařazení do studie. Před dávkováním musí být potvrzena kritéria způsobilosti. Všechny klinické laboratorní testy plánované pro screening budou shromážděny za účelem stanovení výchozí hodnoty před podáním dávky. Mezi další procedury, které musí být dokončeny před zahájením studie, patří úplné fyzikální vyšetření a těhotenský test moči (pro ženy ve fertilním věku).

Studijní návštěvy a postupy: Všichni způsobilí jedinci postoupí do 1. dne, kde budou randomizováni v poměru 1:1 buď k metforminu 1000 mg nebo placebu dvakrát denně po dobu 7 po sobě jdoucích dnů (dny 1-7). V den 4 bude subjektům podána jedna dávka YF17D před dávkováním studovaného léku. Subjekty budou hlásit SingHealth IMU v den 1 (lék před studiem), den 4 (před YF17D), dny 5, 7, 11, 14, 18 (pouze pro účastníky, kteří souhlasí se studiem scRNA-seq a T-buněk ) a 32. den pro výzkumné odběry krve. Harmonogram odběrů krve bude stejný pro všechny studijní skupiny. Všechny výzkumné krevní vzorky budou skladovány při -80oC, dokud nebude dokončen odběr před analýzou. Nábor subjektů a odběr krve budou prováděny jako ambulantní studie v SingHealth Investigational Medicine Unit (IMU), specializovaném zařízení rané fáze klinického hodnocení. Na základě našich předchozích zkušeností předpokládáme, že nebudeme mít potíže s náborem požadovaného počtu účastníků do naší studie, který je nezbytný ke splnění naší cílové velikosti vzorku.

Sledování a postupy po studiu: Nejsou žádné požadavky na sledování nebo postupy po studiu.

Plán monitorování bezpečnosti: Studii mohou hodnotit vládní inspektoři/regulační orgány, kterým musí být umožněn přístup k e-CRF, zdrojovým dokumentům a dalším souborům studií. Inspektoři zkontrolují CRF a porovnají je se zdrojovými dokumenty, aby ověřili přesný a úplný sběr dat a potvrdili, že studie je prováděna v souladu s protokolem, ICH-Good Clinical Practices (ICH-GCP) a všemi platnými předpisy.

Známé časté nežádoucí účinky metforminu zahrnují průjem, nevolnost, bolest žaludku, pálení žáhy a nadýmání. Mezi vzácné AE patří laktátová acidóza a hypoglykémie. Omezení délky podávání metforminu na 10 dnů by dále snížilo riziko těchto závažných AE. Subjekty budou vyškoleny, aby si všímaly časných příznaků souvisejících s těmito AE a aby okamžitě hlásily IMU, pokud se u nich objeví některý z těchto příznaků. Podrobnosti o terminologii AE události, datum a čas začátku a konce události, závažnost, použití CTCAE nebo poskytnuté léčby, dopad na práci a pokračování studie a konečný výsledek události budou zaznamenány v kazuistice až do vyřešení události.

Během studie zkoušející nabere subjekty, stejně jako provede úplnou anamnézu a fyzikální vyšetření při plánovaných i neplánovaných návštěvách. Zkoušející také zkontroluje deníky subjektu pro jakékoli potenciální vedlejší účinky a bude řídit nežádoucí účinky na základě nejlepší klinické praxe, pokud by se objevily. Dodržování protokolu studie bude kontrolováno odebráním anamnézy, počtu pilulek a kontrolou deníku, jakož i měřením hladiny metforminu ve specifických časových bodech.

Zajištění kvality dat: PI a Co-Is budou pravidelně přezkoumávat studii za účelem monitorování dat a bezpečnosti. Interní kontroly kvality budou provádět dvě CRC, která jsou členy studijního týmu. Údaje zadané jedním CRC budou zkontrolovány jiným pomocí zdrojových dokumentů. Studie může být také vybrána ke sledování Úřadem pro integritu a shodu výzkumu SingHealth (ORIC) nebo vyhodnocena vládními inspektory/regulačními orgány, kterým musí být povolen přístup k e-CRF, zdrojovým dokumentům a dalším souborům studií. Monitorující/inspektoři mohou revidovat CRF a porovnávat je se zdrojovými dokumenty, aby ověřili přesný a úplný sběr dat a potvrdili, že studie je prováděna v souladu s protokolem, ICH-Good Clinical Practices (ICH-GCP) a všemi platnými předpisy.

Zadávání a ukládání dat: Všechna data účastníků budou při náboru zbavena identifikace. Tištěné formuláře pro sběr výzkumných dat, jako jsou CRF, protokoly a deníky, budou uchovávány v souboru vyšetřovatele a uloženy v SingHealth IMU pod zámkem, přístupné pouze delegovaným členům studijního týmu. Přímý sběr dat demografických a klinických dat bude zachycen na zdrojových dokumentech. Identifikátory budou uchovávány v samostatné složce v jiné kanceláři a bude vynaloženo veškeré úsilí na ochranu soukromí účastníků. Data, která mají být analyzována, budou obsahovat pouze neidentifikovaná data. Bude použit elektronický systém sběru dat. Všechna elektronická data budou chráněna heslem a budou k nim mít přístup pouze členové studijního týmu. Vzorky, výsledky testů nebo údaje o patogenech budou uloženy v laboratoři Duke-NUS EID v samostatném PC, kde je přístup chráněn heslem.

Určení velikosti vzorku: Velikost vzorku 20 na rameno poskytne 80% schopnost detekovat snížení systémových symptomů z 50 % na 10 % (rozdíl v riziku = 0,4 poměr snížení = 0,8) u účastníků, kteří dostávají placebo oproti těm, kteří byli před léčených metforminem oproti skupině s placebem při 2-stranné 5% chybovosti typu I (PASS 13 Software). Při zohlednění možné míry vynechání 10 % je celková velikost vzorku celkem 44 (22 na rameno). Na základě našich předchozích zkušeností s náborem subjektů ve studii vakcíny proti YF nedošlo během 1měsíčního období sledování k žádnému vyřazení. Jsme si proto jisti, že ve zkušební době dokážeme nabrat požadovaný počet subjektů.

Statistická analýza: Fisherův exaktní test bude použit k posouzení rozdílu v četnosti systémových symptomů mezi placebem a větví před léčbou metforminem. Intervaly spolehlivosti (CI) pro četnost AE budou odhadnuty pomocí přesné metody. CI pro rozdíl mezi riziky bude odhadnut pomocí metody Newcombova skóre.

Diagnostické grafy budou použity k určení volby použití nezpracovaných dat nebo log-transformovaných dat v parametrických analýzách nebo neparametrických analýzách. Rozdíly v titru neutralizačních protilátek anti-YF v den 28, virémie a exprese SBREP-1 budou porovnány mezi skupinami s placebem a skupinami s metforminem. Regresními metodami bude zkoumán vztah mezi systémovými příznaky, molekulárními koreláty imunogenicity, virémií, titrem protilátek a metforminem. Rozdíly v základních charakteristikách mezi subjekty, které mají a nemají počátek systémových příznaků, budou zahrnuty do analýzy upravené na kovariát.

Stanovení hladiny studovaného léčiva v krvi: Hladiny studovaného léčiva budou měřeny metodou kapalinové chromatografie-tandemové hmotnostní spektrometrie (LC-MS/MS). Test bude proveden na systému Shimadzu 8060 LC-MS/MS, který je dostupný v Singapurské všeobecné nemocnici.

Studie genové exprese: Genová exprese v plné krvi by byla provedena pomocí testu Nanostring nCounter. Tento test poskytuje multiplexní přístup k identifikaci genů, které výzkumník dříve použil k ověření zásahů z mikročipu, které identifikovaly adaptivní ER stres jako faktor náchylnosti k symptomatické infekci YF17D (viz předběžné údaje). Důležité je, že výzkumník spolupracoval s Nanostringem na přizpůsobení komplexní sady sond, které jsou schopny přímo kvantifikovat mRNA transkripty v ER stresových a TCA cyklických drahách, což by byly cílové geny v této studii. Tento přístup je zvolen i z důvodu rozpočtového omezení ČSA. Studijní tým nicméně shromáždí další klinické vzorky jako zálohu a prozkoumá použití RNAseq k objevu farmakogenomiky metforminu prostřednictvím dodatečného financování z jiných grantových zdrojů.

Tato navrhovaná studie genové exprese bude provedena ve Viral Research and Experimental Medicine Center @ SingHealth Duke-NUS (ViREMiCS). ViREMiCS založil PI a spolupracovník Eng Eong Ooi jako výzkumné centrum v partnerství SingHealth Duke-NUS Academic Medicine Center. Založila sadu nástrojů molekulární a systémové biologie na podporu a urychlení klinických studií prokazujících koncept. Vyšetřovatelé tak nepředpokládají žádný problém při použití tohoto přístupu k měření genové exprese ve vzorcích krve.

Proteomika a metabolomické profilování: Plazmatická metabolomika bude zkoumána pomocí kapilární elektroforézy/hmotnostní spektrometrie (CE/MS) a kapalinové chromatografie/hmotnostní spektrometrie LC-MS/MS, jak jsme dříve použili k měření polárních metabolitů z glykolýzy a cyklu TCA [18 , 25]. Proteomika bude měřena pomocí LC-MS/MS. Tyto testy budou prováděny s použitím základního vybavení dostupného v Programu v oblasti Emerging Infectious Diseases and Metabolomics Core Facility, obojí v Duke-NUS. To umožní multi-omický přístup k podpoře lepších biologických náhledů.

Chemokin a cytokin: Hladiny chemokinů a cytokinů v séru budou měřeny pomocí testu Luminex nebo Olink, který umožňuje měřit více než 40 sérových chemokinů a cytokinů současně.

Titry YF virémie a PRNT: Zátěž viremií YF bude hodnocena pomocí kvantitativní PCR v reálném čase (qRT-PCR). Titry neutralizačních protilátek anti-YF budou měřeny neutralizačním testem redukce plaku (PRNT). Stručně řečeno, 50 PFU (plaque forming units) viru YF17D se inkubuje s dvojnásobným sériovým ředěním lidského séra po dobu jedné hodiny při 37 °C a poté se přidá k monovrstvě buněk Vero na 24jamkových destičkách. O hodinu později se médium odsaje a buňky se překryjí 1% karboxymethylcelulózou v udržovacím médiu. Po 5 dnech budou buňky fixovány, promyty a obarveny krystalovou violetí. Bude spočítán počet plaků a titry PRNT50 budou určeny pomocí sigmoidní křivky dávka-odpověď proložené jako reciproční hodnoty.

Studie scRNA-seq a T-buněk: Jednobuněčné sekvenování RNA (scRNA-seq) bude provedeno na PBMC izolovaných před a po léčbě metforminem, aby se určil dopad léčby metforminem na různé podskupiny imunitních buněk. Tato navrhovaná studie bude provedena ve spolupráci s Genome Biology Facility v Duke-NUS. Následně, s použitím zjištění scRNA-seq jako vodítka, pak vyhodnotíme funkci a aktivitu T-buněk pomocí průtokové cytometrie nebo testu ELISPOT (enzyme-linked immunoabsorbent spot). Tyto testy budou prováděny s použitím základního vybavení dostupného v programu pro vznikající infekční nemoci v Duke-NUS.