Modulálja a celluláris stresszt az immunsejtekben, hogy csökkentse a tünetekkel járó vírusfertőzések arányát

A toborzás és a toborzási folyamat kritériumai: Az alanyokat a SingHealth Investigational Medicine Unit (IMU) egészséges önkéntesek adatbázisából és a toborzási plakátokból veszik fel. Az alanyok megkapják a Résztvevői Tájékoztató és a Tájékoztatott beleegyezési űrlap egy példányát, amelyet érkezéskor elolvashatnak. A vizsgálattal kapcsolatos eligazító ülést a nyomozó tart. Ezt követően az alanyokat bevezetik egy privát helyiségbe, ahol tájékozott beleegyezést kapnak, és ahol a vizsgálattal kapcsolatos kérdéseket szabadon feltehetik. Az alanyokat nem kell elsietni a vizsgálatban való részvételről szóló döntés meghozatalával. Arra ösztönzik őket, hogy beszéljenek családtagjaikkal a vizsgálatban való részvételről; és lehetővé tették, hogy döntésüket (bármilyen sérelem nélkül) a családtagjaikkal való megbeszélésig elhalasszák.

Szűrési látogatások és eljárások: Az alanyokat a SingHealth Investigational Medicine Unit (IMU) segítségével veszik fel. A vizsgálattal kapcsolatos bármely eljárás vagy értékelés elvégzése előtt tájékozott írásos beleegyezést kell szerezni. Minden alany alkalmasságát a vizsgálatba való felvételre a szűrési látogatás során értékelni kell. Az alanyoknak meg kell felelniük a 3.3. és a 3.4. szakaszban felsorolt ​​összes felvételi és kizárási kritériumnak, hogy jogosultak legyenek a vizsgálatba való felvételre. Az adagolás előtt meg kell erősíteni a jogosultsági kritériumokat. A szűrésre tervezett összes klinikai laboratóriumi vizsgálatot össze kell gyűjteni az adagolás előtti kiindulási érték megállapításához. Egyéb eljárások, amelyeket a vizsgálat megkezdése előtt el kell végezni, magukban foglalják a teljes fizikális vizsgálatot és a vizeletből történő terhességi tesztet (fogamzóképes nők esetében).

Tanulmányi látogatások és eljárások: Minden alkalmas alany az 1. napra kerül, ahol 1:1 arányban randomizálják őket 1000 mg metforminra vagy placebóra naponta kétszer 7 egymást követő napon (1-7. nap). A 4. napon az alanyok egy adag YF17D-t kapnak a vizsgálati gyógyszer adagolása előtt. Az alanyok az 1. napon (vizsgálat előtti gyógyszer), a 4. napon (YF17D előtt), az 5., 7., 11., 14., 18. napon jelentkeznek a SingHealth IMU-nál (csak azon résztvevők esetében, akik beleegyeznek az scRNA-seq és T-sejt vizsgálatokba) ) és a 32. nap a kutatási vérvételre. A vérvételek ütemezése minden vizsgálati csoportban azonos lesz. Minden kutatási vérmintát -80 oC-on tárolnak, amíg az elemzés előtt be nem fejeződik a felvétel. Az alanyok toborzását és a vérvételt ambuláns vizsgálatként végzik majd a SingHealth Investigational Medicine Unit (IMU) korai fázisú klinikai vizsgálati létesítményében. Korábbi tapasztalataink alapján azt várjuk, hogy nem okoz nehézséget a szükséges számú résztvevő felvétele a vizsgálatunkba, amely szükséges ahhoz, hogy elérjük a megcélzott mintanagyságot.

A vizsgálat utáni nyomon követés és eljárások: Nincs követelmény a vizsgálat utáni nyomon követésre vagy eljárásokra.

Biztonsági felügyeleti terv: A tanulmányt kormányzati ellenőrök/szabályozó hatóságok értékelhetik, akiknek hozzáférést kell biztosítani az e-CRF-ekhez, forrásdokumentumokhoz és egyéb tanulmányi fájlokhoz. Az ellenőrök áttekintik a CRF-eket, és összehasonlítják azokat a forrásdokumentumokkal, hogy ellenőrizzék a pontos és teljes adatgyűjtést, és megerősítsék, hogy a vizsgálatot a protokollnak, az ICH-Good Clinical Practices (ICH-GCP) és az összes vonatkozó előírásnak megfelelően hajtják végre.

A metformin ismert gyakori mellékhatásai közé tartozik a hasmenés, hányinger, gyomorfájdalom, gyomorégés és puffadás. A ritka mellékhatások közé tartozik a tejsavas acidózis és a hipoglikémia. A metformin adagolásának időtartamának 10 napra történő korlátozása tovább csökkentené e súlyos mellékhatások kockázatát. Az alanyokat kiképezik arra, hogy figyeljenek az ezekkel a nemkívánatos eseményekkel kapcsolatos korai tünetekre, és azonnal jelentsék az IMU-nak, ha e tünetek bármelyikét észlelik. Az AE esemény terminológiájának részleteit, az esemény kezdetének és befejezésének dátumát és időpontját, súlyosságát, a CTCAE vagy adott kezelés használatát, a munkára és a vizsgálat folytatására gyakorolt ​​hatást, valamint az esemény végső kimenetelét a megoldásig rögzítik az esetjelentésben. az eseményről.

A vizsgálat során a vizsgáló felveszi az alanyokat, valamint teljes anamnézist és fizikális vizsgálatot végez mind a tervezett, mind a nem tervezett látogatásokon. A vizsgáló az alany naplóit is áttekinti az esetleges mellékhatások tekintetében, és a legjobb klinikai gyakorlat alapján kezeli a nemkívánatos eseményeket, ha felmerülnek. A vizsgálati protokollnak való megfelelést a gyógyszeres anamnézis, a tabletták számának és a napló ellenőrzésével, valamint a metformin gyógyszerszintjének meghatározott időpontokban történő mérésével ellenőrzik.

Adatok minőségbiztosítása: A PI és a társszervezetek rendszeresen felülvizsgálják a vizsgálatot az adatok és a biztonsági ellenőrzés érdekében. A belső minőségellenőrzéseket két CRC végzi, akik a vizsgálati csoport tagjai. Az egyik CRC által bevitt adatokat egy másik ellenőrzi a forrásdokumentumok segítségével. A tanulmányt az SingHealth Kutatási Integritási és Megfelelőségi Hivatal (ORIC) is kiválaszthatja megfigyelésre, vagy kormányzati ellenőrök/szabályozó hatóságok értékelhetik, akiknek hozzáférést kell biztosítani az e-CRF-ekhez, forrásdokumentumokhoz és egyéb tanulmányi fájlokhoz. A monitorok/felügyelők áttekinthetik a CRF-eket és összehasonlíthatják azokat a forrásdokumentumokkal, hogy ellenőrizzék az adatok pontos és teljes gyűjtését, és megerősítsék, hogy a vizsgálatot a protokollnak, az ICH-Good Clinical Practices (ICH-GCP) és az összes vonatkozó előírásnak megfelelően végzik.

Adatbevitel és tárolás: A toborzáskor minden résztvevő adata azonosításra kerül. A nyomtatott nyomtatott kutatási adatgyűjtési űrlapokat, például a CRF-eket, naplókat és naplókat a nyomozói webhelyfájlban tárolják, és a SingHealth IMU-ban zárolás alatt tárolják, és csak a delegált vizsgálati csoport tagjai férhetnek hozzá. A demográfiai és klinikai adatok közvetlen adatrögzítését a forrásdokumentumok rögzítik. Az azonosítókat egy másik irodában külön fájlban tárolják, és mindent megtesznek a résztvevők magánéletének védelme érdekében. Az elemezni kívánt adatok csak azonosítatlan adatokat tartalmaznak. Elektronikus adatrögzítő rendszer kerül alkalmazásra. Minden elektronikus adat jelszóval védett, és csak a vizsgálati csoport tagjai férhetnek hozzá. A mintákat, a vizsgálati eredményeket vagy a kórokozók adatait a Duke-NUS EID laboratóriuma egy önálló PC-n tárolja, ahol a hozzáférés jelszóval védett.

A minta méretének meghatározása: A karonkénti 20-as minta 80%-os teljesítményt ad a szisztémás tünetek 50%-ról 10%-ra történő csökkenésének kimutatására (kockázatkülönbség = 0,4 csökkentési arány = 0,8) a placebót kapó résztvevőknél a kezelés előttiekhez képest. metforminnal kezelték a placebo csoporttal szemben, kétoldalú, 5%-os I. típusú hibaaránnyal (PASS 13 Software). A 10%-os potenciális lemorzsolódást figyelembe véve a teljes mintanagyság összesen 44 (22 karonként). Az YF vakcinakísérletben az alanyok toborzásával kapcsolatos korábbi tapasztalataink szerint az 1 hónapos követési időszak során nem volt lemorzsolódás. Ezért bízunk benne, hogy a próbaidőn belül a szükséges számú alanyt tudunk toborozni.

Statisztikai elemzés: A Fisher-féle egzakt tesztet fogják használni a szisztémás tünetek közötti különbség értékelésére a placebo és a metformin kezelés előtti kar között. Az AE-arányok konfidencia intervallumait (CI) a pontos módszerrel becsülik meg. A kockázati különbség CI-jét a Newcombe-féle pontszám módszerrel becsüljük meg.

Diagnosztikai diagramokat kell használni annak meghatározására, hogy a nyers adatokat vagy a log-transzformált adatokat használjuk-e paraméteres vagy nem paraméteres elemzésekben. A 28. napon, a virémiában és az SBREP-1 expressziójában az anti-YF neutralizáló antitest titerben mutatkozó különbségeket a placebo és a metformin csoportok között hasonlítjuk össze. A szisztémás tünetek, az immunogenitás molekuláris korrelációi, a virémia, az antitesttiter és a metformin közötti összefüggések feltárása regressziós módszerekkel történik. A szisztémás tüneteket fellépő és nem jelentkező alanyok háttérjellemzőiben mutatkozó különbségeket a kovariáns korrigált elemzés figyelembe veszi.

A vizsgált gyógyszer vérszintjének meghatározása: A vizsgált gyógyszerszinteket folyadékkromatográfiás-tandem tömegspektrometriás (LC-MS/MS) vizsgálati módszerrel mérik. A vizsgálatot Shimadzu 8060 LC-MS/MS rendszeren hajtják végre, amely a szingapúri általános kórházban kapható.

Génexpressziós vizsgálatok: A génexpressziót teljes vérben Nanostring nCounter assay segítségével végezzük. Ez a vizsgálat egy multiplex megközelítést biztosít azon gének azonosítására, amelyeket a vizsgáló korábban használt a microarray találatainak validálására, amelyek az adaptív ER stresszt a tünetekkel járó YF17D fertőzés érzékenységi tényezőjeként azonosították (lásd az előzetes adatokat). Fontos, hogy a kutató együttműködött a Nanostringgel, hogy testre szabjon egy átfogó szondát, amely képes közvetlenül számszerűsíteni az mRNS-transzkriptumot az ER stressz- és a TCA-ciklusútvonalakban, amelyek ebben a kísérletben a célgének lennének. Ezt a megközelítést választották a CSA költségvetési korlátai miatt is. Mindazonáltal a kutatócsoport tartalékként további klinikai mintákat fog gyűjteni, és megvizsgálja az RNAseq felhasználását a metformin farmakogenomikájának felfedezésére más pályázati forrásokból származó kiegészítő finanszírozás révén.

Ezt a javasolt génexpressziós vizsgálatot a SingHealth Duke-NUS (ViREMiCS) Víruskutató és Kísérleti Orvostudományi Központban végzik. A ViREMiCS-t a PI és munkatársa, Eng Eong Ooi hozta létre a SingHealth Duke-NUS Academic Medicine Center partnerség kutatóközpontjaként. Molekuláris és rendszerbiológiai eszközöket hozott létre, amelyek támogatják és felgyorsítják a klinikai vizsgálatok bizonyítását. A kutatók tehát nem számítanak semmilyen problémára, ha ezt a megközelítést alkalmazzák a vérminták génexpressziójának mérésére.

Proteomika és metabolomprofil: A plazma metabolomikát kapilláris elektroforézis/tömegspektrometria (CE/MS) és folyadékkromatográfia/tömegspektrometria LC-MS/MS segítségével vizsgáljuk, ahogyan azt korábban is alkalmaztuk a glikolízisből és a TCA-ciklusból származó poláris metabolitok mérésére [18]. , 25]. A proteomikát LC-MS/MS segítségével mérjük. Ezeket a vizsgálatokat az Emerging Infectious Diseases and Metabolomics Core Facility programban rendelkezésre álló alapvető berendezések segítségével hajtják végre, mindkettő Duke-NUS-ban. Ez lehetővé teszi a több ómikus megközelítést a fokozott biológiai betekintés támogatásához.

Kemokin és citokin: A szérum kemokin- és citokinszintjét a Luminex vagy Olink-teszt segítségével mérik, amely lehetővé teszi több mint 40 szérumkemokin és citokin egyidejű mérését.

YF viremia és PRNT titerek: Az YF virémia terhelést kvantitatív valós idejű PCR (qRT-PCR) segítségével értékeljük. Az anti-YF neutralizáló antitest titereket plakkredukciós neutralizációs teszttel (PRNT) kell mérni. Röviden, 50 PFU (plakkképző egység) YF17D vírust inkubálunk a humán szérum kétszeres sorozathígításaival 1 órán át 37 oC-on, majd hozzáadjuk a Vero-sejtek egyrétegű rétegéhez 24 lyukú lemezeken. Egy órával később a táptalajt leszívjuk, és a sejteket karboxi-metil-cellulózzal fedjük be a fenntartó tápközegben. 5 nap elteltével a sejteket rögzítjük, mossuk és kristályibolyával festjük. A plakkok számát megszámoljuk, és a PRNT50 titereket a szigmoid dózis-válasz görbe illesztésével, mint reciprok értékek határozzuk meg.

scRNA-seq és T-sejt vizsgálatok: Egysejtes RNS-szekvenálást (scRNA-seq) végeznek a metformin-kezelés előtt és után izolált PBMC-ken, hogy meghatározzák a metformin-kezelés hatását a különböző immunsejt-alcsoportokra. Ezt a javasolt tanulmányt a Duke-NUS Genome Biology Facility-vel együttműködésben fogják elvégezni. Ezt követően az scRNA-seq eredményeit útmutatóként felhasználva értékeljük a T-sejtek funkcióját és aktivitását áramlási citometriával vagy enzim-kapcsolt immunabszorbens folt (ELISPOT) vizsgálattal. Ezeket a vizsgálatokat a Duke-NUS-ban az Emerging Infectious Diseases Programban elérhető alapvető berendezések segítségével végzik el.