调节免疫细胞中的细胞应激以降低有症状的病毒感染率

招募标准和招募流程：受试者将从 SingHealth 研究医学部 (IMU) 健康志愿者数据库和招募海报中招募。 受试者将获得一份参与者信息和知情同意书的副本，以便在他们到达时阅读。 研究者将主持关于该研究的简报会。 此后，受试者将被带到一个私人房间，在那里获得知情同意并可以自由询问有关研究的问题。 受试者不会仓促做出参加研究的决定。 将鼓励他们与其家人谈论参与研究；并允许推迟他们的决定（不带任何偏见），直到与家人讨论后。

筛选访问和程序：将通过 SingHealth 研究医学部门 (IMU) 招募受试者。 在执行任何与研究相关的程序或评估之前，将获得知情的书面同意。 必须在筛选访问期间评估所有受试者是否有资格招募到研究中。 受试者必须分别满足第 3.3 节和第 3.4 节中概述的所有纳入和排除标准，才有资格参加研究。 资格标准必须在给药前确认。 将收集计划用于筛选的所有临床实验室测试以建立给药前基线。 在研究开始前必须完成的其他程序包括全面的身体检查和尿妊娠试验（针对有生育能力的女性受试者）。

研究访问和程序：所有符合条件的受试者将进入第 1 天，在那里他们将以 1:1 的比例随机分配至二甲双胍 1000mg 或安慰剂，每天两次，连续 7 天（第 1-7 天）。 在第 4 天，受试者将在研究药物给药前服用一剂 YF17D。 受试者将在第 1 天（研究前药物）、第 4 天（YF17D 前）、第 5、7、11、14、18 天（仅适用于同意 scRNA-seq 和 T 细胞研究的参与者）向 SingHealth IMU 报告) 和第 32 天用于研究血液采样。 所有研究组的抽血时间表都相同。 所有研究血液样本都将储存在 -80oC 下，直到招募完成后再进行分析。 受试者招募和血液采集将作为门诊研究在 SingHealth Investigational Medicine Unit (IMU) 进行，这是一个专门的早期临床试验机构。 根据我们之前的经验，我们预计我们将不难招募所需数量的参与者进入我们的研究，以满足我们的目标样本量。

研究后跟进和程序：没有研究后跟进或程序的要求。

安全监控计划：研究可能由政府检查员/监管机构评估，他们必须被允许访问 e-CRF、源文件和其他研究文件。 检查员将审查 CRF 并将其与源文件进行比较，以验证数据收集的准确性和完整性，并确认研究是根据方案、ICH-Good Clinical Practices (ICH-GCP) 和所有适用法规进行的。

二甲双胍已知的常见不良事件包括腹泻、恶心、胃痛、胃灼热和腹胀。 罕见的 AE 包括乳酸性酸中毒和低血糖。 将二甲双胍给药的持续时间限制在 10 天将进一步降低这些严重 AE 的风险。 将训练受试者注意与这些 AE 相关的早期症状，并在遇到任何这些症状时立即向 IMU 报告。 AE 事件术语的详细信息、事件开始和结束的日期和时间、严重程度、使用 CTCAE 或给予的治疗、对工作和研究继续进行的影响以及事件的最终结果将记录在病例报告中，直至解决事件的。

在研究期间，研究者将招募受试者，并在计划和计划外的访问中进行全面的病史采集和体格检查。 研究者还将审查受试者的日记以了解任何潜在的副作用，并在出现不良事件时根据最佳临床实践对其进行管理。 将通过获取用药史、药丸计数和检查日记以及在特定时间点测量二甲双胍药物水平来检查对研究方案的遵守情况。

数据质量保证：PI 和 Co-Is 将定期审查研究以进行数据和安全监控。 内部质量检查将由作为研究团队成员的两名 CRC 执行。 一个 CRC 输入的数据将由另一个使用源文件进行检查。 SingHealth 研究诚信与合规办公室 (ORIC) 也可能会挑选该研究进行监测，或由必须允许其访问 e-CRF、源文件和其他研究文件的政府检查员/监管机构进行评估。 监督员/检查员可以审查 CRF 并将其与源文件进行比较，以验证数据收集的准确性和完整性，并确认研究是根据方案、ICH-Good Clinical Practices (ICH-GCP) 和所有适用法规进行的。

数据输入和存储：所有参与者的数据将在招募时去识别化。 硬拷贝研究数据收集表格，如 CRF、日志和日记，将保存在研究者的站点文件中，并在锁和钥匙下存储在 SingHealth IMU 中，仅授权研究团队成员可以访问。 人口统计和临床数据的直接数据捕获将在源文档中捕获。 标识符将保存在另一个办公室的单独文件中，并将尽一切努力保护参与者的隐私。 要分析的数据将仅包含去标识化的数据。 将使用电子数据采集系统。 所有电子数据都将受到密码保护，并且只能由研究团队成员访问。 标本、测试结果或病原体数据将存储在 Duke-NUS EID 实验室的独立 PC 中，访问受密码保护。

样本量的确定：每组 20 个样本量将提供 80% 的功效来检测接受安慰剂的参与者与接受安慰剂的参与者的全身症状从 50% 减少到 10%（风险差异 = 0.4，减少比率 = 0.8）二甲双胍组与安慰剂组相比，I 类错误率为 2 侧 5%（PASS 13 软件）。 考虑到 10% 的潜在辍学率，总样本量为 44（每臂 22）。 根据我们之前在 YF 疫苗试验中招募受试者的经验，在 1 个月的随访期间没有脱落。 因此，我们有信心在试用期内招募到所需数量的受试者。

统计分析：Fisher 精确检验将用于评估安慰剂和二甲双胍预处理组之间全身症状发生率的差异。 将使用精确方法估算 AE 率的置信区间 (CI)。 将使用 Newcombe 评分法估计风险差异的 CI。

诊断图将用于确定在参数分析或非参数分析中使用原始数据或对数转换数据的选择。 将在安慰剂组和二甲双胍组之间比较第 28 天时抗 YF 中和抗体滴度、病毒血症和 SBREP-1 表达的差异。 全身症状、免疫原性的分子相关性、病毒血症、抗体滴度和二甲双胍之间的关系将通过回归方法进行探索。 有和没有出现全身症状的受试者之间的背景特征差异将包括在协变量调整分析中。

研究药物血液水平的测定：研究药物水平将通过液相色谱-串联质谱 (LC-MS/MS) 测定方法测量。 该测定将在新加坡中央医院提供的 Shimadzu 8060 LC-MS/MS 系统上进行。

基因表达研究：全血中的基因表达将使用 Nanostring nCounter 测定法进行。 该测定提供了一种多重方法来识别研究人员以前用来验证微阵列命中的基因，这些基因将适应性 ER 应激确定为症状性 YF17D 感染的易感因素（参见初步数据）。 重要的是，研究人员与 Nanostring 合作定制了一套全面的探针，这些探针能够直接量化 ER 应激和 TCA 循环途径中的 mRNA 转录本，这将是本试验的目标基因。 由于 CSA 预算限制，也选择了这种方法。 尽管如此，研究团队将收集额外的临床样本作为备份，并通过其他资助来源的额外资金探索使用 RNAseq 发现二甲双胍的药物基因组学。

这项拟议的基因表达研究将在 SingHealth Duke-NUS (ViREMiCS) 的病毒研究和实验医学中心进行。 ViREMiCS 由 PI 和合作者 Eng Eong Ooi 建立，作为 SingHealth Duke-NUS 学术医学中心合作伙伴关系的研究中心。 它已经建立了一套分子和系统生物学工具来支持和加速概念验证临床试验。 因此，研究人员预计使用这种方法测量血液样本中的基因表达不会有任何问题。

蛋白质组学和代谢组学分析：血浆代谢组学将使用毛细管电泳/质谱 (CE/MS) 和液相色谱/质谱 LC-MS/MS 进行检查，因为我们之前曾用于测量糖酵解和 TCA 循环中的极性代谢物 [18] , 25]。 蛋白质组学将使用 LC-MS/MS 进行测量。 这些检测将使用 Duke-NUS 新发传染病项目和代谢组学核心设施中可用的核心设备进行。 这将使多组学方法能够支持增强的生物学见解。

趋化因子和细胞因子：将使用 Luminex 或 Olink 测定法测量血清趋化因子和细胞因子水平，该测定法能够同时测量 40 多种血清趋化因子和细胞因子。

YF 病毒血症和 PRNT 滴度：YF 病毒血症负荷将使用定量实时 PCR (qRT-PCR) 进行评估。 将通过噬菌斑减少中和试验 (PRNT) 测量抗 YF 中和抗体滴度。 简言之，将 50 PFU（噬菌斑形成单位）的 YF17D 病毒与 2 倍连续稀释的人血清在 37oC 下孵育一小时，然后添加到 24 孔板中的单层 Vero 细胞中。 一小时后，将吸出培养基，并在维持培养基中用 1% 的羧甲基纤维素覆盖细胞。 5 天后，细胞将被固定、洗涤并用结晶紫染色。 将计算斑块的数量并使用 S 形剂量-反应曲线拟合作为倒数值来确定 PRNT50 滴度。

scRNA-seq 和 T 细胞研究：将对二甲双胍治疗前后分离的 PBMC 进行单细胞 RNA 测序 (scRNA-seq)，以确定二甲双胍治疗对不同免疫细胞亚群的影响。 这项拟议的研究将与 Duke-NUS 的基因组生物学设施合作进行。 随后，以 scRNA-seq 的发现为指导，我们将使用流式细胞术或酶联免疫吸附点 (ELISPOT) 测定评估 T 细胞功能和活性。 这些检测将使用杜克-新加坡国立大学新发传染病项目中可用的核心设备进行。