Modula lo stress cellulare nelle cellule immunitarie per ridurre il tasso di infezione virale sintomatica

Criteri per il reclutamento e il processo di reclutamento: i soggetti saranno reclutati dal database di volontari sani dell'Unità di medicina sperimentale SingHealth (IMU) e dai manifesti di reclutamento. Ai soggetti verrà consegnata una copia delle informazioni del partecipante e del modulo di consenso informato da leggere al loro arrivo. Una sessione informativa sullo studio sarà condotta dallo sperimentatore. Successivamente, i soggetti verranno introdotti in una stanza privata dove si ottiene il consenso informato e dove possono essere poste liberamente domande sullo studio. I soggetti non saranno affrettati a prendere una decisione per partecipare allo studio. Saranno incoraggiati a parlare con i loro familiari della partecipazione allo studio; e consentito di rinviare la loro decisione (senza alcun pregiudizio) di partecipare fino a dopo la discussione con i loro familiari.

Visite e procedure di screening: i soggetti saranno reclutati tramite l'Unità di medicina sperimentale di SingHealth (IMU). Il consenso informato scritto sarà ottenuto prima che venga eseguita qualsiasi procedura o valutazione correlata allo studio. L'idoneità di tutti i soggetti al reclutamento nello studio deve essere valutata durante la visita di screening. I soggetti devono soddisfare tutti i criteri di inclusione ed esclusione delineati rispettivamente nella Sezione 3.3 e nella Sezione 3.4 per essere idonei all'arruolamento nello studio. I criteri di ammissibilità devono essere confermati prima della somministrazione. Tutti i test clinici di laboratorio programmati per lo screening saranno raccolti per stabilire il valore di riferimento pre-dose. Altre procedure che devono essere completate prima dell'inizio dello studio includono un esame fisico completo e un test di gravidanza urinario (per soggetti di sesso femminile in età fertile).

Visite e procedure di studio: tutti i soggetti idonei procederanno al Giorno 1, dove verranno randomizzati 1:1 a metformina 1000 mg o placebo due volte al giorno per 7 giorni consecutivi (giorni 1-7). Il giorno 4, ai soggetti verrà somministrata una dose di YF17D prima della somministrazione del farmaco in studio. I soggetti riferiranno all'IMU SingHealth il giorno 1 (farmaco pre-studio), il giorno 4 (pre-YF17D), i giorni 5, 7, 11, 14, 18 (solo per i partecipanti che acconsentono agli studi scRNA-seq e T-cell ) e il giorno 32 per il prelievo di sangue per la ricerca. Il programma per i prelievi di sangue sarà identico per tutti i gruppi di studio. Tutti i campioni di sangue della ricerca verranno conservati a -80 ° C fino al completamento del reclutamento prima dell'analisi. Il reclutamento dei soggetti e la raccolta del sangue saranno condotti come studio ambulatoriale presso la SingHealth Investigational Medicine Unit (IMU), una struttura dedicata alla sperimentazione clinica in fase iniziale. Dalla nostra precedente esperienza, prevediamo che non avremo difficoltà a reclutare il numero richiesto di partecipanti nel nostro studio necessario per soddisfare la dimensione del nostro campione target.

Follow-up e procedure post-studio: non sono richiesti follow-up o procedure post-studio.

Piano di monitoraggio della sicurezza: lo studio può essere valutato da ispettori governativi/autorità di regolamentazione a cui deve essere consentito l'accesso a e-CRF, documenti di origine e altri file di studio. Gli ispettori esamineranno i CRF e li confronteranno con i documenti di origine per verificare la raccolta accurata e completa dei dati e confermare che lo studio viene condotto secondo il protocollo, ICH-Good Clinical Practices (ICH-GCP) e tutte le normative applicabili.

Gli eventi avversi comuni noti della metformina includono diarrea, nausea, mal di stomaco, bruciore di stomaco e gonfiore. Gli eventi avversi rari includono acidosi lattica e ipoglicemia. Limitare la durata della somministrazione di metformina a 10 giorni ridurrebbe ulteriormente il rischio di questi eventi avversi gravi. I soggetti saranno addestrati a prestare attenzione ai primi sintomi associati a questi eventi avversi e a riferire immediatamente all'IMU se manifestano uno qualsiasi di questi sintomi. I dettagli della terminologia dell'evento AE, la data e l'ora di inizio e fine dell'evento, la gravità, l'utilizzo del CTCAE o il trattamento somministrato, l'impatto sul lavoro e sulla continuazione dello studio e l'esito finale dell'evento saranno registrati sul case report fino alla risoluzione dell'evento.

Durante lo studio, lo sperimentatore recluterà i soggetti, oltre a eseguire l'anamnesi completa e l'esame fisico sia alle visite programmate che a quelle non programmate. Lo sperimentatore esaminerà anche i diari del soggetto per eventuali potenziali effetti collaterali e gestirà gli eventi avversi in base alla migliore pratica clinica qualora dovessero insorgere. La conformità al protocollo di studio sarà verificata prendendo una storia del farmaco, e conteggio delle pillole e ispezione del diario, nonché misurazione del livello del farmaco metformina in punti temporali specifici.

Garanzia della qualità dei dati: il PI e il Co-I rivedranno periodicamente lo studio per il monitoraggio dei dati e della sicurezza. I controlli di qualità interni saranno eseguiti da due CRC che sono membri del gruppo di studio. I dati inseriti da un CRC saranno verificati da un altro utilizzando i documenti di origine. Lo studio può anche essere selezionato per il monitoraggio da SingHealth Office of Research Integrity and Compliance (ORIC) o valutato da ispettori governativi/autorità di regolamentazione a cui deve essere consentito l'accesso a e-CRF, documenti di origine e altri file di studio. I monitor/ispettori possono rivedere i CRF e confrontarli con i documenti di origine per verificare la raccolta accurata e completa dei dati e confermare che lo studio è condotto secondo il protocollo, ICH-Good Clinical Practices (ICH-GCP) e tutte le normative applicabili.

Inserimento e archiviazione dei dati: tutti i dati dei partecipanti verranno resi anonimi al momento del reclutamento. I moduli cartacei di raccolta dei dati di ricerca come CRF, registri e diari saranno conservati nel file del sito dello sperimentatore e archiviati in SingHealth IMU sotto chiave, accessibili solo ai membri delegati del team di studio. L'acquisizione diretta dei dati demografici e clinici verrà acquisita sui documenti di origine. Gli identificatori saranno conservati in un file separato in un altro ufficio e sarà fatto ogni sforzo per proteggere la privacy dei partecipanti. I dati da analizzare conterranno solo dati anonimi. Verrà utilizzato un sistema elettronico di acquisizione dei dati. Tutti i dati elettronici saranno protetti da password e saranno accessibili solo ai membri del gruppo di studio. I campioni, i risultati dei test oi dati sui patogeni verranno archiviati presso il laboratorio Duke-NUS EID in un PC autonomo in cui l'accesso è protetto da password.

Determinazione della dimensione del campione: una dimensione del campione di 20 per braccio fornirà l'80% di potere per rilevare una riduzione dei sintomi sistemici dal 50% al 10% (differenza di rischio = 0,4 rapporto di riduzione = 0,8) nei partecipanti che ricevono placebo rispetto a quelli che sono pre- trattato con metformina rispetto al gruppo placebo con un tasso di errore di tipo I bilaterale del 5% (software PASS 13). Considerando un potenziale tasso di abbandono del 10%, la dimensione totale del campione è di 44 in totale (22 per braccio). Dalla nostra precedente esperienza con il reclutamento di soggetti nella sperimentazione del vaccino YF, non ci sono stati abbandoni durante il periodo di follow-up di 1 mese. Pertanto, siamo fiduciosi di poter reclutare il numero richiesto di soggetti entro il periodo di prova.

Analisi statistica: il test esatto di Fisher verrà utilizzato per valutare la differenza nel tasso di sintomi sistemici tra il braccio di pre-trattamento con placebo e metformina. Gli intervalli di confidenza (CI) per i tassi di AE saranno stimati utilizzando il metodo esatto. L'IC per la differenza di rischio sarà stimato utilizzando il metodo del punteggio di Newcombe.

I grafici diagnostici verranno utilizzati per determinare la scelta di utilizzare i dati grezzi oi dati trasformati in log in analisi parametriche o analisi non parametriche. Le differenze nel titolo anticorpale neutralizzante anti-YF al giorno 28, la viremia e l'espressione di SBREP-1 saranno confrontate tra i gruppi placebo e metformina. La relazione tra sintomi sistemici, correlati molecolari di immunogenicità, viremia, titolo anticorpale e metformina sarà esplorata con metodi di regressione. Le differenze nelle caratteristiche di fondo tra i soggetti che hanno e non hanno un'insorgenza di sintomi sistemici saranno incluse nell'analisi aggiustata per covariate.

Determinazione del livello ematico del farmaco in studio: i livelli del farmaco in studio saranno misurati mediante un metodo di analisi della cromatografia liquida-spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS). Il test verrà eseguito su un sistema Shimadzu 8060 LC-MS/MS, disponibile presso il Singapore General Hospital.

Studi sull'espressione genica: l'espressione genica nel sangue intero verrebbe eseguita utilizzando il test Nanostring nCounter. Questo test fornisce un approccio multiplex per identificare i geni che il ricercatore ha precedentemente utilizzato per convalidare i colpi del microarray che hanno identificato lo stress ER adattivo come fattore di suscettibilità per l'infezione sintomatica da YF17D (vedi dati preliminari). È importante sottolineare che l'investigatore ha lavorato con Nanostring, per personalizzare un set completo di sonde in grado di quantificare direttamente le trascrizioni di mRNA nei percorsi dello stress ER e del ciclo TCA, che sarebbero i geni bersaglio in questo studio. Questo approccio è stato scelto anche a causa del vincolo di bilancio del CSA. Tuttavia, il team dello studio raccoglierà campioni clinici extra come backup ed esplorerà l'uso di RNAseq per scoprire la farmacogenomica della metformina attraverso ulteriori finanziamenti da altre fonti di sovvenzione.

Questo studio di espressione genica proposto sarà condotto presso il Viral Research and Experimental Medicine Center @ SingHealth Duke-NUS (ViREMiCS). ViREMiCS è stato fondato dal PI e collaboratore, Eng Eong Ooi come centro di ricerca nella partnership SingHealth Duke-NUS Academic Medicine Center. Ha creato una serie di strumenti di biologia molecolare e dei sistemi per supportare e accelerare gli studi clinici di proof of concept. I ricercatori quindi non prevedono alcun problema nell'utilizzo di questo approccio per misurare l'espressione genica nei campioni di sangue.

Proteomica e profilazione metabolomica: la metabolomica plasmatica sarà esaminata mediante elettroforesi capillare/spettrometria di massa (CE/MS) e cromatografia liquida/spettrometria di massa LC-MS/MS come abbiamo precedentemente impiegato per misurare i metaboliti polari dalla glicolisi e dal ciclo TCA [18 , 25]. La proteomica sarà misurata usando LC-MS/MS. Questi test saranno eseguiti utilizzando le apparecchiature di base disponibili nel Programma in Emerging Infectious Diseases e Metabolomics Core Facility, entrambi in Duke-NUS. Ciò consentirà un approccio multi-omico per supportare approfondimenti biologici avanzati.

Chemochine e citochine: i livelli sierici di chemochine e citochine saranno misurati utilizzando il test Luminex o Olink che consente di misurare simultaneamente più di 40 chemochine e citochine sieriche.

Titoli di viremia YF e PRNT: i carichi di viremia YF saranno valutati mediante PCR quantitativa in tempo reale (qRT-PCR). I titoli anticorpali neutralizzanti anti-YF saranno misurati mediante test di neutralizzazione della riduzione della placca (PRNT). In breve, 50 PFU (unità formanti placche) del virus YF17D saranno incubate con diluizioni seriali di 2 volte di siero umano per un'ora a 37°C, e quindi aggiunte a un monostrato di cellule Vero in piastre da 24 pozzetti. Un'ora dopo, il terreno sarà aspirato e le cellule saranno ricoperte con carbossimetilcellulosa all'1% in terreno di mantenimento. Dopo 5 giorni, le cellule saranno fissate, lavate e colorate con cristalvioletto. Il numero di placche sarà contato ei titoli di PRNT50 determinati utilizzando una curva sigmoidea dose-risposta adattata come valori reciproci.

scRNA-seq e studi sulle cellule T: il sequenziamento dell'RNA a singola cellula (scRNA-seq) verrà eseguito su PBMC isolati prima e dopo il trattamento con metformina per determinare l'impatto del trattamento con metformina su diversi sottogruppi di cellule immunitarie. Questo studio proposto sarà condotto in collaborazione con la Genome Biology Facility di Duke-NUS. Successivamente, utilizzando i risultati di scRNA-seq come guida, valuteremo la funzione e l'attività delle cellule T utilizzando la citometria a flusso o il dosaggio del punto di assorbimento immunitario legato all'enzima (ELISPOT). Questi test saranno eseguiti utilizzando le apparecchiature di base disponibili nel Programma in malattie infettive emergenti in Duke-NUS.