Monocyten en NK-celactiviteit bij Covid-19-patiënten
Studie van immuungemedieerde mechanismen bij patiënten die positief zijn getest op SARS-CoV-2: fenotypische en functionele analyse van monocyten en NK-cellen in het bloed van proefpersonen die zijn getroffen door Covid 19
SARS-CoV-2 behoort tot de bèta-coronavirusfamilie en de transmissieroute en symptomen volgen die van alle door de gemeenschap verworven coronavirussen. Het belangrijkste verschil met het nieuwe Coronavirus is het hogere sterftecijfer, dat is ongeveer 3%.
Het sterftecijfer is meer dan 1% alleen voor patiënten ouder dan 50 jaar, terwijl tot 40 jaar minder dan 0,4% is. Tot op heden zijn er geen dodelijke slachtoffers onder kinderen onder de 10 jaar. Het sterftecijfer is bijna het dubbele voor mannen in plaats van voor vrouwen. Deze verdeling van het sterftecijfer naar leeftijd van geïnfecteerde patiënten kon slechts gedeeltelijk worden toegeschreven aan andere comorbiditeiten naast de hoge leeftijd. In feite hebben patiënten zonder reeds bestaande aandoeningen echter een sterftecijfer van 0,9%.
Het bijna nulcijfer van ernstige ziekte bij kinderen en in het algemeen bij patiënten jonger dan 40 jaar is nogal onverklaarbaar. Baby's, kinderen en jongeren kunnen besmet zijn, maar de infectie geneest snel of zonder symptomen. Oudere patiënten lopen ernstig longletsel op als gevolg van een laat opkomende immuunrespons.
Een mogelijke verklaring voor deze verschijnselen zou iets kunnen zijn dat ervoor zorgt dat jongere mensen snel kunnen reageren op SARS-CoV-2, onafhankelijk van de nieuwigheid van het virus zelf.
Het lijkt erop dat jongere mensen al gevoelig zijn voor de antigenen van het virus zonder eerder contact.
Deze immuniteit is niet echt specifiek, maar "gedeeltelijk specifiek" voor veel antigenen van het virus, maar kan de infectie in het organisme beperken. Iets stimuleerde het immuunsysteem en het verspreidde de immuniteit tegen steeds meer aanwezige antigenen. Kinderen zijn de leeftijdsgroep die het meest wordt blootgesteld aan alle in de gemeenschap circulerende virussen.
Deze immuniteit is niet persistent maar vervaagt geleidelijk. Het beschermt vanaf de leeftijd van twee jaar, wanneer de hypothetische stimulatie optreedt, tot het vijfde decennium vanwege de langzame afname.
De enige externe stimulans die gezonde mensen krijgen, zijn vaccins. Alle vaccinaties en vooral tetanie, difterietoxoïden en geïnactiveerde bacteriën zoals kinkhoest kunnen het immuunsysteem stimuleren. Ze ontwikkelen de specifieke immuniteit, maar genereren ook een ontspruitende immuniteit tegen antigenen die onderweg zijn, zoals coronavirussen en andere in de gemeenschap circulerende virussen.
De ontwikkelde immuniteit geeft jarenlang enige bescherming tegen meervoudige virale infectie totdat de natuurlijke uitdooft.
Na het vijfde decennium wordt die immuniteit langzamer teruggeroepen en opnieuw geactiveerd. Bovendien lijken ontvangers van transplantaties en hiv-geïnfecteerde patiënten, die een geremd immuunsysteem hebben, onverwachts niet te lijden onder de ergste complicaties van een SARS-CoV-2-infectie. Een onevenwichtigheid in het immuunsysteem kan een cruciale rol spelen tijdens de reactie op het virus, waardoor de destructieve gevolgen van overmatige ontsteking worden beperkt.
Volgens de medische hypothese waarop het protocol is gebaseerd, zouden jonge mensen kunnen profiteren van een functionele aanpassing van aangeboren immuuncellen die wordt geïnduceerd door epigenetische herprogrammering en vooral van een reeds bestaande "gedeeltelijk specifieke" immuniteit tegen de gemeenschapsvirussen veroorzaakt door "omstanders". effect" van voorgaande vaccinaties. In deze studie zullen we de belangrijkste verschillen onderzoeken die bestaan tussen patiënten die zijn geïnfecteerd met SARS-CoV-2 en die de ziekte in verschillende mate van ernst ervaren. We veronderstellen verschillende patiëntenpopulaties te herkennen, elk met een specifiek immunologisch patroon. Het zou kunnen verschillen in termen van cytokines, oplosbare factoren serumniveau en immuuncelactiviteit zowel van het aangeboren compartiment als van het verworven compartiment. Het bewijs van een rol van deze immunologische verschijnselen in de pathogenese van Covid-19 vormt de basis voor de implementatie van therapeutische immunomodulerende behandelingen. Bovendien zou de definitie van een immunologisch risicoprofiel gevestigde therapieën kunnen afstemmen op elk type patiënt.
Studie Overzicht
Toestand
Gedetailleerde beschrijving
Volgens de medische hypothese waarop het protocol is gebaseerd, zouden jonge mensen kunnen profiteren van een functionele aanpassing van aangeboren immuuncellen die wordt geïnduceerd door epigenetische herprogrammering en vooral van een reeds bestaande "gedeeltelijk specifieke" immuniteit tegen de gemeenschapsvirussen veroorzaakt door "omstanders". effect" van voorgaande vaccinaties. In deze studie zullen we de belangrijkste verschillen onderzoeken die bestaan tussen patiënten die zijn geïnfecteerd met SARS-CoV-2 en die de ziekte in verschillende mate van ernst ervaren. We veronderstellen verschillende patiëntenpopulaties te herkennen, elk met een specifiek immunologisch patroon. Het zou kunnen verschillen in termen van cytokines, oplosbare factoren serumniveau en immuuncelactiviteit zowel van het aangeboren compartiment als van het verworven compartiment.
Er worden gegevens verzameld met behulp van 3 benaderingen:
- Een experimentele analyse, voor clusters van patiënten, om de aangeboren immuunrespons te bestuderen en de genetische profielen te identificeren.
- Een epidemiologische analyse om de vaccinatiegeschiedenis van de patiënten te identificeren;
- Een klinische analyse om het immunologische profiel op te sporen;
Voor de specifieke analyse, om de aangeboren immuunrespons te bestuderen en om de genetische profielen te identificeren, zullen wetenschappers uit het perifere bloed NK-cellen, monocyten, CD4- en CD8-T-cellen van beide groepen analyseren: gezonde patiënten (negatief getest op SARS-CoV -2) en zieke patiënten van de subgroepen (AS 19, PAU19, POL19, ARD19).
Van verschillende groepen patiënten zullen bloedmonsters (10-15 ml) in EDTA-buisjes worden getrokken, gedurende 10 minuten bij 360 g worden gecentrifugeerd om plasma te verkrijgen dat bij -80°C wordt bewaard voor latere analyse op relevante cytokines en chemokines door ELISA (IL-1b, IL-6, TNF, IFN-a, IL-10, IL-12, CCL2 en CXCL10) aan het einde van de inschrijving.
De celpellets zullen worden teruggebracht tot het oorspronkelijke volume met PBS en 1:1 (v/v) verdund, en vervolgens worden onderworpen aan een dichtheidsgradiëntstratificatie met Ficoll Histopaque-1077, bij 500 g gedurende 30 minuten. De Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMC's) afkomstig van de witte ring worden verzameld, tweemaal gewassen in PBS en vervolgens gebruikt voor daaropvolgende experimenten met behulp van een flowcytometerassay (REFF). De in vitro kweek met behulp van PBMC's kan variëren van ex vivo 1 dag tot enkele dagen, en de cellen worden bewaard in RPMI 1640-medium, aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS), 2 mM l-glutamine, 100 U/mL penicilline en 100 μg/ml streptomycine (P/S), bij 37°C, 5% CO2.
Om ex vivo fluorescentie-geactiveerde celsorteerder (FACS) fenotype-analyse uit te voeren, wordt 2,5 x 105 verse totale PBMC's per FACS-buis gedurende 30 minuten bij 4 °C gekleurd met monoklonale antilichamen (mAbs), als volgt: CD3-PerCP, CD56-APC , CD16-FITC, NKG2A-PE, NKG2C-PE, NKGD2-PE, DNAM-1-PE, CD25-PE, CD69-PE. Na de Forward/Side Scatter-instelling worden NK-cellen geïdentificeerd in twee subsets van cellen, d.w.z. als CD3- en CD56dim CD16+-cellen (CD56dim NK-cellen, de belangrijkste subset, ongeveer 90%), en CD3- en CD56bright CD16-/low-cellen ( CD56bright NK-cellen, de kleine subset, ongeveer 10%). Andere markerexpressie zal worden geëvalueerd op beide subsets van gated cellen.
Voor ex vivo FACS-evaluatie van fenotype-analyse van monocyten wordt 2,5 x 105 verse totale PBMC's per FACS-buis gedurende 30 minuten bij 4°C gekleurd met mAb's als volgt: CD45-APC, CD14-FITC en CD16-V450, PE-CD209, PE-CD80. Na de Forward/Side Scatter-instelling worden monocyten geïdentificeerd in drie subsets, d.w.z. als CD14+- en CD16--cellen (de hoofdsubset, ongeveer 90%), CD14+ CD16+ (de kleine subset, ongeveer 10%) en CD14-/low CD16+ (de andere kleine subset).
We zullen ook het fenotype evalueren voor CD4- en CD8-T-cellen en de CD4/CD8-T-ratio met behulp van 2x105 verse totale PBMC's, zoals eerder beschreven, met de volgende mAb's: CD3-PerCP, CD4-APC, CD8-V450 en T-regulatory (Treg ) cellen, als CD3-PerCP, CD4-APC, CD25-PE.
PBMC's zullen ook gedurende 4 uur in vitro worden gestimuleerd met verschillende soorten stimuli, zoals LPS (herkend door de TLR4), poly(I:C) (herkend door de TLR3), poly (I:C) plus IL-2 plus IL-12 en forbolmyristaatacetaat (PMA) plus ionomycine in aanwezigheid van monensin en brefeldin. Deze procedure zal het mogelijk maken om de specifieke productie van cytokine/chemokine uit NK-cellen en monocyten te bestuderen met behulp van een FACS intracellulaire assay, zoals eerder beschreven (REFF). Voor NK-cellen zullen we IFN-a-PE, TNF-PE, CCL2-PE, CXCL10-PE en CD107a-PE (degranulatiemarker) meten. Voor monocyten zullen we onderzoeken: IL-6-PE, TNFa-PE, IL-12-PE, CXCL10-PE (M1-type pro-inflammatoire markers) en TGFb-PE, IL-10-PE, CCL18-PE (M2 -type anti-inflammatoire markers) Wanneer de hoeveelheid PBMC's voldoende is, zullen andere functionele in-vitrotesten op NK-cellen en monocyten worden opgezet. In het bijzonder zullen PBMC's worden bestudeerd voor 4 uur NK-celdegranulatie/cytotoxische functie naar erytroleucemische K562-cellijn die oppervlakte-CD107a-PE beoordeelt met behulp van een flowcytofluorimetrische assay (REFF).
Wanneer de hoeveelheid PBMC's voldoende is, zullen monocyten worden gezuiverd met behulp van anti-CD14-microbeads met magnetische separator en NK-cellen met RosetteSep-kit om >90% gezuiverde celpopulaties te verkrijgen.
Gezuiverde monocyten en gezuiverd NK konden gescheiden of samen in kweek worden gehouden met behulp van RPMI 1640-medium met 10% FBS en aangevuld met respectievelijk M-CSF en IL-2, gestimuleerd met verschillende stimuli (zie hierboven) en vervolgens gecontroleerd op intracellulaire cytokines /chemokinen van belang (zie hierboven). Tegelijkertijd konden de supernatanten (geconditioneerd medium, CM) worden geoogst aan het einde van de in vitro incubatiekweek en worden beoordeeld op cytokines/chemokines met behulp van ELISA (IL-1b, IL-6, TNFa, IFNa, IL-10, IL- 12, CXCL10).
De 4-5 dagen in vitro kweek van monocyten zal 24 uur verder worden gestimuleerd met LPS plus IFNg (M1-stimulus) of (IL-4) (M2-stimulus) om macrofaagpolarisatie te onderzoeken door M1-markers aan het oppervlak (TNF, CXCL10) of M2-markers te bestuderen (IL-10, CCL18) om de prevalentie van macrofaagpolarisatie bij verschillende groepen Covid-19-patiënten te controleren.
De epidemiologische analyse zal worden uitgevoerd waarbij zowel de vaccinatiegeschiedenis als de gegevens die dagelijks na ziekenhuisopname worden verzameld, worden geïntegreerd. ATS Insubria-archieven bieden ontbrekende gegevens.
Gezien het immunologische profiel zullen patiënten met Covid-19 worden getest voor routineonderzoeken en het volgende:
- immunofenotypering van lymfocyten;
- bepaling van de activiteit van C3- en C4-complementfracties;
- immunoglobuline (IgG, IgM, IgA, IgE) serumniveau;
- serum eiwitelektroforese;
- Angiotensin Converting Enzyme (ACE) serumspiegel;
- CMV (Citomegalovirus) serologische test;
- IL-6 serumniveau.
Studietype
Inschrijving (Verwacht)
Contacten en locaties
Studie Locaties
-
-
-
Varese, Italië, 21100
- Werving
- ATS Insubria
-
Contact:
- Giuseppe Ietto, M.D.
- Telefoonnummer: +393398758024
- E-mail: giuseppe.ietto@gmail.com
-
Hoofdonderzoeker:
- Giuseppe Ietto, MD
-
Hoofdonderzoeker:
- Lorenzo Mortara, Professor
-
Onderonderzoeker:
- Domenico Iovino, MD
-
Onderonderzoeker:
- Daniela Dalla Gasperina, Professor
-
Hoofdonderzoeker:
- Giulio Carcano, Professor
-
Onderonderzoeker:
- Andreina Baj, MD
-
Onderonderzoeker:
- Walter Ageno, Professor
-
Onderonderzoeker:
- Francesco Acquati, Professor
-
Onderonderzoeker:
- Angelo Genoni, Dr
-
Onderonderzoeker:
- Denisa Baci, PhD
-
Onderonderzoeker:
- Matteo Gallazzi, PhD
-
Onderonderzoeker:
- Annarosaria De Vito, PhD
-
Onderonderzoeker:
- Elisa Monti, MD
-
Onderonderzoeker:
- Andrea Vigezzi, MD
-
Onderonderzoeker:
- Caterina Franchi, MD
-
Onderonderzoeker:
- Valentina Iori, MD
-
Onderonderzoeker:
- Federica Masci, MD
-
-
Deelname Criteria
Geschiktheidscriteria
Leeftijden die in aanmerking komen voor studie
Accepteert gezonde vrijwilligers
Geslachten die in aanmerking komen voor studie
Bemonsteringsmethode
Studie Bevolking
Beschrijving
Inclusiecriteria:
- Leeftijd: ≥ 18
- SARS-CoV-2 gedocumenteerde infectie
Uitsluitingscriteria:
- Weigering om de overeenkomst te ondertekenen (geïnformeerde toestemming);
- Onvermogen om de overeenkomst te ondertekenen;
- HIV-, HCV-, HBV-infectie (positief voor HBsAg).
Studie plan
Hoe is de studie opgezet?
Ontwerpdetails
- Observatiemodellen: Case-Alleen
- Tijdsperspectieven: Prospectief
Cohorten en interventies
Groep / Cohort |
Interventie / Behandeling |
|---|---|
|
Positief getest op SARS-CoV-2
Patiënten die positief zijn getest op SARS-CoV-2, zullen worden gerekruteerd op de eerste hulp van het academisch ziekenhuis "Ospedale Di Circolo - ASST Settelaghi" in Varese.
|
Fenotypische en functionele analyse van monocyten en NK-cellen
|
Wat meet het onderzoek?
Primaire uitkomstmaten
Uitkomstmaat |
Maatregel Beschrijving |
Tijdsspanne |
|---|---|---|
|
Immuuncellen activiteit
Tijdsspanne: 6 maanden
|
De hypothese van wetenschappers is dat monocyten, NK-, CD4- en CD8-T-cellen bij patiënten met een ernstige infectie met SARS-CoV-2 een stoornis in hun functie vertonen: cellen vertonen een overweldigende hyperactiviteit die een pathologische ontstekingsreactie uitlokt met een massale productie van pro-inflammatoire cytokine, oedeem en longfibrose.
|
6 maanden
|
Secundaire uitkomstmaten
Uitkomstmaat |
Maatregel Beschrijving |
Tijdsspanne |
|---|---|---|
|
Beschermende factoren en nieuwe therapeutische strategieën
Tijdsspanne: 6 maanden
|
De secundaire doelstellingen zijn om klinische gegevens en vaccinatiegeschiedenis te correleren met het laboratoriumimmuunpatroon om beschermende factoren voor Covid 19 te identificeren en wegen te openen voor nieuwe therapeutische strategieën.
|
6 maanden
|
Medewerkers en onderzoekers
Onderzoekers
- Studie stoel: Giulio Carcano, Professor, Università degli Studi dell'Insubria
- Hoofdonderzoeker: Giuseppe Ietto, M.D., Università degli Studi dell'Insubria
- Hoofdonderzoeker: Lorenzo Mortara, Professor, Università degli Studi dell'Insubria
Publicaties en nuttige links
Algemene publicaties
- Netea MG, Dominguez-Andres J, Barreiro LB, Chavakis T, Divangahi M, Fuchs E, Joosten LAB, van der Meer JWM, Mhlanga MM, Mulder WJM, Riksen NP, Schlitzer A, Schultze JL, Stabell Benn C, Sun JC, Xavier RJ, Latz E. Defining trained immunity and its role in health and disease. Nat Rev Immunol. 2020 Jun;20(6):375-388. doi: 10.1038/s41577-020-0285-6. Epub 2020 Mar 4.
- Benn CS, Netea MG, Selin LK, Aaby P. A small jab - a big effect: nonspecific immunomodulation by vaccines. Trends Immunol. 2013 Sep;34(9):431-9. doi: 10.1016/j.it.2013.04.004. Epub 2013 May 14.
- Ietto G. SARS - CoV-2: Reasons of epidemiology of severe ill disease cases and therapeutic approach using trivalent vaccine (tetanus, diphtheria and Bordetella pertussis). Med Hypotheses. 2020 Aug;141:109779. doi: 10.1016/j.mehy.2020.109779. Epub 2020 Apr 22.
- Murray PJ, Allen JE, Biswas SK, Fisher EA, Gilroy DW, Goerdt S, Gordon S, Hamilton JA, Ivashkiv LB, Lawrence T, Locati M, Mantovani A, Martinez FO, Mege JL, Mosser DM, Natoli G, Saeij JP, Schultze JL, Shirey KA, Sica A, Suttles J, Udalova I, van Ginderachter JA, Vogel SN, Wynn TA. Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 2014 Jul 17;41(1):14-20. doi: 10.1016/j.immuni.2014.06.008.
- Noonan DM, De Lerma Barbaro A, Vannini N, Mortara L, Albini A. Inflammation, inflammatory cells and angiogenesis: decisions and indecisions. Cancer Metastasis Rev. 2008 Mar;27(1):31-40. doi: 10.1007/s10555-007-9108-5.
- Parisi L, Gini E, Baci D, Tremolati M, Fanuli M, Bassani B, Farronato G, Bruno A, Mortara L. Macrophage Polarization in Chronic Inflammatory Diseases: Killers or Builders? J Immunol Res. 2018 Jan 14;2018:8917804. doi: 10.1155/2018/8917804. eCollection 2018.
- Bruno A, Focaccetti C, Pagani A, Imperatori AS, Spagnoletti M, Rotolo N, Cantelmo AR, Franzi F, Capella C, Ferlazzo G, Mortara L, Albini A, Noonan DM. The proangiogenic phenotype of natural killer cells in patients with non-small cell lung cancer. Neoplasia. 2013 Feb;15(2):133-42. doi: 10.1593/neo.121758.
- Bruno A, Bassani B, D'Urso DG, Pitaku I, Cassinotti E, Pelosi G, Boni L, Dominioni L, Noonan DM, Mortara L, Albini A. Angiogenin and the MMP9-TIMP2 axis are up-regulated in proangiogenic, decidual NK-like cells from patients with colorectal cancer. FASEB J. 2018 Oct;32(10):5365-5377. doi: 10.1096/fj.201701103R. Epub 2018 May 15.
- Bassani B, Baci D, Gallazzi M, Poggi A, Bruno A, Mortara L. Natural Killer Cells as Key Players of Tumor Progression and Angiogenesis: Old and Novel Tools to Divert Their Pro-Tumor Activities into Potent Anti-Tumor Effects. Cancers (Basel). 2019 Apr 1;11(4):461. doi: 10.3390/cancers11040461.
- Morandi F, Horenstein AL, Chillemi A, Quarona V, Chiesa S, Imperatori A, Zanellato S, Mortara L, Gattorno M, Pistoia V, Malavasi F. CD56brightCD16- NK Cells Produce Adenosine through a CD38-Mediated Pathway and Act as Regulatory Cells Inhibiting Autologous CD4+ T Cell Proliferation. J Immunol. 2015 Aug 1;195(3):965-72. doi: 10.4049/jimmunol.1500591. Epub 2015 Jun 19.
- Ietto G, Mortara L, Dalla Gasperina D, Iovino D, Azzi L, Baj A, Ageno W, Genoni AP, Acquati F, Gallazzi M, Spina G, Coco G, Pierin F, Noonan D, Vigezzi A, Monti E, Iori V, Masci F, Franchi C, Di Saverio S, Carcano G. Immune-Mediated Mechanisms in Patients Testing Positive for SARS-CoV-2: Protocol for a Multianalysis Study. JMIR Res Protoc. 2022 Jan 25;11(1):e29892. doi: 10.2196/29892.
Studie record data
Bestudeer belangrijke data
Studie start (Werkelijk)
Primaire voltooiing (Verwacht)
Studie voltooiing (Verwacht)
Studieregistratiedata
Eerst ingediend
Eerst ingediend dat voldeed aan de QC-criteria
Eerst geplaatst (Werkelijk)
Updates van studierecords
Laatste update geplaatst (Werkelijk)
Laatste update ingediend die voldeed aan QC-criteria
Laatst geverifieerd
Meer informatie
Termen gerelateerd aan deze studie
Aanvullende relevante MeSH-voorwaarden
Andere studie-ID-nummers
- 67/2020
Plan Individuele Deelnemersgegevens (IPD)
Bent u van plan om gegevens van individuele deelnemers (IPD) te delen?
Informatie over medicijnen en apparaten, studiedocumenten
Bestudeert een door de Amerikaanse FDA gereguleerd geneesmiddel
Bestudeert een door de Amerikaanse FDA gereguleerd apparaatproduct
Deze informatie is zonder wijzigingen rechtstreeks van de website clinicaltrials.gov gehaald. Als u verzoeken heeft om uw onderzoeksgegevens te wijzigen, te verwijderen of bij te werken, neem dan contact op met register@clinicaltrials.gov. Zodra er een wijziging wordt doorgevoerd op clinicaltrials.gov, wordt deze ook automatisch bijgewerkt op onze website .