Monociták és NK-sejtek aktivitása Covid-19-betegekben
A SARS-CoV-2-re pozitívnak bizonyult betegek immunmediált mechanizmusainak vizsgálata: Monociták és NK-sejtek fenotípusos és funkcionális elemzése a Covid 19 által érintett egyének vérében
A SARS-CoV-2 a béta-koronavírusok családjába tartozik, és terjedési útvonala és tünetei követik az összes közösségben szerzett koronavírusét. Az új koronavírus fő különbsége a magasabb, 3% körüli halálozási arány.
A halálozási arány csak az 50 év feletti betegeknél haladja meg az 1%-ot, míg a 40 éves korig 0,4% alatti. A 10 év alatti gyermekek körében a mai napig nem jelentettek halálesetet. A halálozási arány csaknem kétszerese a férfiaknál, mint a nőknél. A halálozási aránynak a fertőzött betegek életkora szerinti megoszlása csak részben tudható be a nagy életkor mellett egyéb társbetegségekre is. Valójában azonban azoknak a betegeknek a halálozási aránya, akiknek nincs előzetes állapota, 0,9%.
A gyermekek és általában a 40 évnél fiatalabb betegek súlyos betegségeinek szinte nulla aránya teljesen megmagyarázhatatlan. Csecsemők, gyermekek és fiatalok megfertőződhetnek, de a fertőzés gyorsan elmúlik vagy tünetmentes. Az idősebb betegek súlyos tüdősérülést szenvednek a későn jelentkező immunválasz következtében.
Ezeknek a jelenségeknek a magyarázata lehet valami, ami biztosítja a SARS-CoV-2-vel szembeni azonnali választ a fiatalabb emberekben, függetlenül a vírus újszerűségétől.
Úgy tűnik, hogy a fiatalabbak előzetes érintkezés nélkül már érzékenyek a vírus antigénjére.
Ez az immunitás nem igazán specifikus, de „részben specifikus” a vírus számos antigénjére, de képes korlátozni a fertőzést a szervezetben. Valami serkentette az immunrendszert, és egyre több antigén ellen szórta szét az immunitást. A gyerekek azt a korosztályt jelentik, amely leginkább ki van téve a közösségben keringő vírusoknak.
Ez az immunitás nem tartós, hanem fokozatosan elhalványul. Két éves kortól, amikor a feltételezett ingerlés bekövetkezik, az ötödik évtizedig véd a lassú csökkenése miatt.
Az egyetlen külső stimuláció, amelyet egészséges emberek kapnak, a vakcinák. Minden oltás, különösen a tetaniás, diftéria toxoidok és az inaktivált baktériumok, mint a pertussis, serkenthetik az immunrendszert. Kifejlesztik a specifikus immunitást, de csírázó immunitást is generálnak a tranzitban lévő antigének, például koronavírusok és más közösségben keringő vírusok ellen.
A kialakult immunitás évekig védelmet nyújt a többszörös vírusfertőzés ellen, amíg a természetes el nem múlik.
Az ötödik évtized után ezt az immunitást lassabban hívják vissza és aktiválják újra. Ezenkívül a transzplantált betegek és a HIV-fertőzött betegek, akiknek immunrendszere váratlanul gátolt, nem szenvednek a SARS-CoV-2 fertőzés legrosszabb szövődményeitől. Az immunrendszer egyensúlyhiánya kulcsszerepet játszhat a vírusra adott reakció során, korlátozva a túlzott gyulladás pusztító következményeit.
Az orvosi hipotézis, amelyen a protokoll alapul korábbi oltások hatása". Ebben a tanulmányban feltárjuk a fő különbségeket a SARS-CoV-2-vel fertőzött betegek között, akiknél a betegség eltérő súlyosságú. Feltételezzük, hogy a betegek különböző populációit ismerjük fel, mindegyiknek sajátos immunológiai mintázata van. Mind a veleszületett, mind a szerzett kompartmentben különbözhet a citokinek, az oldható faktorok szérumszintje és az immunsejtek aktivitása tekintetében. Ezeknek az immunológiai jelenségeknek a Covid-19 patogenezisében betöltött szerepének bizonyítása a terápiás immunmoduláns kezelések megvalósításának alapja. Ezen túlmenően az immunológiai kockázati profil meghatározása minden egyes betegtípushoz testreszabhatja a kialakult terápiákat.
A tanulmány áttekintése
Állapot
Részletes leírás
Az orvosi hipotézis, amelyen a protokoll alapul korábbi oltások hatása". Ebben a tanulmányban feltárjuk a fő különbségeket a SARS-CoV-2-vel fertőzött betegek között, akiknél a betegség eltérő súlyosságú. Feltételezzük, hogy a betegek különböző populációit ismerjük fel, mindegyiknek sajátos immunológiai mintázata van. Mind a veleszületett, mind a szerzett kompartmentben különbözhet a citokinek, az oldható faktorok szérumszintje és az immunsejtek aktivitása tekintetében.
Az adatok gyűjtése 3 módszerrel történik:
- Kísérleti elemzés pácienscsoportok számára a veleszületett immunválasz tanulmányozására és a genetikai profilok azonosítására.
- Epidemiológiai elemzés a betegek oltási előzményeinek azonosítása érdekében;
- Klinikai elemzés az immunológiai profil kimutatására;
A konkrét elemzéshez, a veleszületett immunválasz tanulmányozása és a genetikai profilok azonosítása érdekében a tudósok mindkét csoport perifériás véréből NK-sejteket, monocitákat, CD4- és CD8-T-sejteket elemeznek: egészséges betegek (a SARS-CoV-ra negatívnak bizonyult). -2) és az alcsoportok (AS 19, PAU19, POL19, ARD19) beteg páciensei.
A betegek különböző csoportjaiból vérmintákat (10-15 ml) vesznek EDTA-csövekbe, majd 360 g-vel 10 percig centrifugálják, hogy plazmát nyerjenek, amelyet -80 °C-on tárolnak a későbbi, az érdeklődésre számot tartó citokinek és kemokinek elemzéséhez. ELISA-val (IL-1b, IL-6, TNF, IFN-a, IL-10, IL-12, CCL2 és CXCL10) a beiratkozás végén.
A sejtpelleteket PBS-sel visszaállítjuk a kezdeti térfogatra, és 1:1 (v/v) arányban hígítjuk, majd sűrűséggradiens rétegezésnek vetjük alá Ficoll Histopaque-1077-tel, 500 g mellett 30 percig. A fehér gyűrűből származó perifériás vér mononukleáris sejteket (PBMC) összegyűjtjük, kétszer mossuk PBS-ben, majd áramlási citométeres vizsgálattal (REFF) használjuk fel a következő kísérletekhez. A PBMC-ket használó in vitro tenyészet ex vivo 1 naptól néhány napig változhat, és a sejteket RPMI 1640 tápközegben tartják, amelyet 10% borjúmagzati szérummal (FBS), 2 mM l-glutaminnal, 100 U/mL penicillinnel egészítenek ki. és 100 μg/ml sztreptomicin (P/S), 37 °C-on, 5% CO2.
Az ex vivo fluoreszcenciával aktivált sejtválogató (FACS) fenotípus-analízis elvégzéséhez FACS-csövönként 2,5x105 friss összes PBMC-t festenek 30 percig 4 °C-on monoklonális antitestekkel (mAb-k) az alábbiak szerint: CD3-PerCP, CD56-APC , CD16-FITC, NKG2A-PE, NKG2C-PE, NKGD2-PE, DNAM-1-PE, CD25-PE, CD69-PE. A Forward/Side Scatter beállítást követően az NK-sejtek két sejtalcsoportra lesznek azonosítva, azaz CD3- és CD56dim CD16+-sejtekként (CD56dim NK-sejtek, a fő alcsoport körülbelül 90%), valamint CD3- és CD56-fényes CD16-/alacsony sejtek. CD56bright NK-sejtek, a kisebb részhalmaz, körülbelül 10%). A többi marker expresszióját a kapuzott sejtek mindkét alcsoportján értékeljük.
A monociták fenotípus-analízisének ex vivo FACS-értékeléséhez FACS-csövönként 2,5x105 friss összes PBMC-t festenek 30 percig 4 °C-on mAb-ekkel a következők szerint: CD45-APC, CD14-FITC és CD16-V450, PE-CD209, PE-CD80. A Forward/Side Scatter beállítást követően a monociták három alcsoportba kerülnek azonosításra: CD14+ és CD16- sejtek (a fő alcsoport, körülbelül 90%), CD14+ CD16+ (a kisebb részhalmaz, körülbelül 10%) és CD14-/alacsony CD16+. (a másik kisebb részhalmaz).
Ezenkívül értékelni fogjuk a CD4 és CD8 T-sejtek fenotípusát és a CD4/CD8 T-arányt 2x105 friss összes PBMC felhasználásával, a korábban leírtak szerint, a következő mAb-ekkel: CD3-PerCP, CD4-APC, CD8-V450, valamint T szabályozó (Treg) ) sejtek, mint CD3-PerCP, CD4-APC, CD25-PE.
A PBMC-ket in vitro stimulálják 4 órán keresztül különböző típusú ingerekkel, mint például az LPS (a TLR4 által felismert), a poli(I:C) (a TLR3 által felismert), a poli (I:C) és az IL-2 plusz. IL-12 és forbol-mirisztát-acetát (PMA) plusz ionomicin monenzin és brefeldin jelenlétében. Ez az eljárás lehetővé teszi az NK-sejtekből és monocitákból származó specifikus citokin/kemokin termelés tanulmányozását FACS intracelluláris assay segítségével, a korábban leírtak szerint (REFF). Az NK sejtek esetében az IFN-a-PE, TNF-PE, CCL2-PE, CXCL10-PE és CD107a-PE (degranulációs marker) értékeket mérjük. A monociták esetében a következőket vizsgáljuk: IL-6-PE, TNFa-PE, IL-12-PE, CXCL10-PE (M1 típusú gyulladásgátló markerek) és TGFb-PE, IL-10-PE, CCL18-PE (M2). -típusú gyulladásgátló markerek) Amikor a PBMC-k mennyisége elegendő, más funkcionális in vitro teszteket is végeznek NK-sejteken és monocitákon. Közelebbről, a PBMC-ket 4 órás NK-sejtek degranulációja/citotoxikus funkciója szempontjából vizsgálják az eritroleukémiás K562 sejtvonal felé, a felszíni CD107a-PE értékelésével áramlási citofluorimetriás vizsgálattal (REFF).
Amikor a PBMC-k mennyisége elegendő, a monocitákat mágneses szeparátorral ellátott anti-CD14 mikrogyöngyökkel és RosetteSep kittel ellátott NK-sejtekkel tisztítják, hogy több mint 90%-ban tisztított sejtpopulációt kapjanak.
A tisztított monociták és a tisztított NK elkülönítve vagy együtt tenyészetben tarthatók 10% FBS-t tartalmazó RPMI 1640 táptalaj alkalmazásával, M-CSF-fel és IL-2-vel kiegészítve, különböző ingerekkel stimulálva (lásd fent), majd ellenőrizni lehet az intracelluláris citokineket. /érdekes kemokinek (lásd fent). Ezzel egyidejűleg a felülúszókat (kondicionált táptalaj, CM) az in vitro inkubációs tenyészet végén be lehetett gyűjteni, és ELISA-val (IL-1b, IL-6, TNFa, IFNa, IL-10, IL-) meghatározni a citokineket/kemokineket. 12, CXCL10).
A monociták 4-5 napos in vitro tenyésztését 24 órán keresztül tovább stimulálják LPS plusz IFNg-vel (M1 stimulus) vagy (IL-4) (M2 stimulus) a makrofágok polarizációjának vizsgálata céljából felszíni M1 markerek (TNF, CXCL10) vagy M2 markerek vizsgálatával. (IL-10, CCL18) a makrofág polarizáció prevalenciájának ellenőrzésére a Covid-19 betegek különböző csoportjaiban.
Az epidemiológiai elemzés az oltási előzmények és a kórházi felvétel után naponta gyűjtött adatok integrálásával történik. A hiányzó adatokat az ATS Insubria archívuma biztosítja.
Figyelembe véve az immunológiai profilt, a Covid-19-ben szenvedő betegeket rutinvizsgálatokra és a következőkre tesztelik:
- limfocita immunfenotipizálás;
- a C3 és C4 komplement frakciók aktivitásának meghatározása;
- immunglobulin (IgG, IgM, IgA, IgE) szérumszint;
- szérumfehérje elektroforézis;
- Angiotenzin Konvertáló Enzim (ACE) szérumszint;
- CMV (citomegalovírus) szerológiai vizsgálat;
- IL-6 szérumszint.
Tanulmány típusa
Beiratkozás (Várható)
Kapcsolatok és helyek
Tanulmányi helyek
-
-
-
Varese, Olaszország, 21100
- Toborzás
- ATS Insubria
-
Kapcsolatba lépni:
- Giuseppe Ietto, M.D.
- Telefonszám: +393398758024
- E-mail: giuseppe.ietto@gmail.com
-
Kutatásvezető:
- Giuseppe Ietto, MD
-
Kutatásvezető:
- Lorenzo Mortara, Professor
-
Alkutató:
- Domenico Iovino, MD
-
Alkutató:
- Daniela Dalla Gasperina, Professor
-
Kutatásvezető:
- Giulio Carcano, Professor
-
Alkutató:
- Andreina Baj, MD
-
Alkutató:
- Walter Ageno, Professor
-
Alkutató:
- Francesco Acquati, Professor
-
Alkutató:
- Angelo Genoni, Dr
-
Alkutató:
- Denisa Baci, PhD
-
Alkutató:
- Matteo Gallazzi, PhD
-
Alkutató:
- Annarosaria De Vito, PhD
-
Alkutató:
- Elisa Monti, MD
-
Alkutató:
- Andrea Vigezzi, MD
-
Alkutató:
- Caterina Franchi, MD
-
Alkutató:
- Valentina Iori, MD
-
Alkutató:
- Federica Masci, MD
-
-
Részvételi kritériumok
Jogosultsági kritériumok
Tanulmányozható életkorok
Egészséges önkénteseket fogad
Tanulmányozható nemek
Mintavételi módszer
Tanulmányi populáció
Leírás
Bevételi kritériumok:
- Kor: ≥ 18 év
- SARS-CoV-2 dokumentált fertőzés
Kizárási kritériumok:
- A megállapodás aláírásának megtagadása (informált beleegyezés);
- Képtelenség aláírni a megállapodást;
- HIV, HCV, HBV (pozitív HBsAg) fertőzés.
Tanulási terv
Hogyan készül a tanulmány?
Tervezési részletek
- Megfigyelési modellek: Csak esetre
- Időperspektívák: Leendő
Kohorszok és beavatkozások
Csoport / Kohorsz |
Beavatkozás / kezelés |
|---|---|
|
A SARS-CoV-2 teszt pozitív
A SARS-CoV-2-re pozitívnak bizonyult betegeket a varese-i Ospedale Di Circolo - ASST Settelaghi Oktatókórház E.R.-ében veszik fel.
|
Monociták és NK sejtek fenotípusos és funkcionális analízise
|
Mit mér a tanulmány?
Elsődleges eredményintézkedések
Eredménymérő |
Intézkedés leírása |
Időkeret |
|---|---|---|
|
Az immunsejtek aktivitása
Időkeret: 6 hónap
|
A tudósok hipotézise az, hogy a monociták, az NK, CD4 és CD8 T-sejtek súlyos SARS-CoV-2 fertőzésben szenvedő betegeknél működési károsodást mutatnak: a sejtek túlerős hiperaktivitást mutatnak, amely kóros gyulladásos választ vált ki, és tömegesen termel gyulladásos citokin, ödéma és tüdőfibrózis.
|
6 hónap
|
Másodlagos eredményintézkedések
Eredménymérő |
Intézkedés leírása |
Időkeret |
|---|---|---|
|
Védőfaktorok és új terápiás stratégiák
Időkeret: 6 hónap
|
A másodlagos célkitűzések a klinikai adatok és az oltási előzmények és a laboratóriumi immunmintázat közötti korreláció a Covid 19 elleni védőfaktorok azonosítása és az új terápiás stratégiák megnyitása érdekében.
|
6 hónap
|
Együttműködők és nyomozók
Szponzor
Nyomozók
- Tanulmányi szék: Giulio Carcano, Professor, Università degli Studi dell'Insubria
- Kutatásvezető: Giuseppe Ietto, M.D., Università degli Studi dell'Insubria
- Kutatásvezető: Lorenzo Mortara, Professor, Università degli Studi dell'Insubria
Publikációk és hasznos linkek
Általános kiadványok
- Netea MG, Dominguez-Andres J, Barreiro LB, Chavakis T, Divangahi M, Fuchs E, Joosten LAB, van der Meer JWM, Mhlanga MM, Mulder WJM, Riksen NP, Schlitzer A, Schultze JL, Stabell Benn C, Sun JC, Xavier RJ, Latz E. Defining trained immunity and its role in health and disease. Nat Rev Immunol. 2020 Jun;20(6):375-388. doi: 10.1038/s41577-020-0285-6. Epub 2020 Mar 4.
- Benn CS, Netea MG, Selin LK, Aaby P. A small jab - a big effect: nonspecific immunomodulation by vaccines. Trends Immunol. 2013 Sep;34(9):431-9. doi: 10.1016/j.it.2013.04.004. Epub 2013 May 14.
- Ietto G. SARS - CoV-2: Reasons of epidemiology of severe ill disease cases and therapeutic approach using trivalent vaccine (tetanus, diphtheria and Bordetella pertussis). Med Hypotheses. 2020 Aug;141:109779. doi: 10.1016/j.mehy.2020.109779. Epub 2020 Apr 22.
- Murray PJ, Allen JE, Biswas SK, Fisher EA, Gilroy DW, Goerdt S, Gordon S, Hamilton JA, Ivashkiv LB, Lawrence T, Locati M, Mantovani A, Martinez FO, Mege JL, Mosser DM, Natoli G, Saeij JP, Schultze JL, Shirey KA, Sica A, Suttles J, Udalova I, van Ginderachter JA, Vogel SN, Wynn TA. Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 2014 Jul 17;41(1):14-20. doi: 10.1016/j.immuni.2014.06.008.
- Noonan DM, De Lerma Barbaro A, Vannini N, Mortara L, Albini A. Inflammation, inflammatory cells and angiogenesis: decisions and indecisions. Cancer Metastasis Rev. 2008 Mar;27(1):31-40. doi: 10.1007/s10555-007-9108-5.
- Parisi L, Gini E, Baci D, Tremolati M, Fanuli M, Bassani B, Farronato G, Bruno A, Mortara L. Macrophage Polarization in Chronic Inflammatory Diseases: Killers or Builders? J Immunol Res. 2018 Jan 14;2018:8917804. doi: 10.1155/2018/8917804. eCollection 2018.
- Bruno A, Focaccetti C, Pagani A, Imperatori AS, Spagnoletti M, Rotolo N, Cantelmo AR, Franzi F, Capella C, Ferlazzo G, Mortara L, Albini A, Noonan DM. The proangiogenic phenotype of natural killer cells in patients with non-small cell lung cancer. Neoplasia. 2013 Feb;15(2):133-42. doi: 10.1593/neo.121758.
- Bruno A, Bassani B, D'Urso DG, Pitaku I, Cassinotti E, Pelosi G, Boni L, Dominioni L, Noonan DM, Mortara L, Albini A. Angiogenin and the MMP9-TIMP2 axis are up-regulated in proangiogenic, decidual NK-like cells from patients with colorectal cancer. FASEB J. 2018 Oct;32(10):5365-5377. doi: 10.1096/fj.201701103R. Epub 2018 May 15.
- Bassani B, Baci D, Gallazzi M, Poggi A, Bruno A, Mortara L. Natural Killer Cells as Key Players of Tumor Progression and Angiogenesis: Old and Novel Tools to Divert Their Pro-Tumor Activities into Potent Anti-Tumor Effects. Cancers (Basel). 2019 Apr 1;11(4):461. doi: 10.3390/cancers11040461.
- Morandi F, Horenstein AL, Chillemi A, Quarona V, Chiesa S, Imperatori A, Zanellato S, Mortara L, Gattorno M, Pistoia V, Malavasi F. CD56brightCD16- NK Cells Produce Adenosine through a CD38-Mediated Pathway and Act as Regulatory Cells Inhibiting Autologous CD4+ T Cell Proliferation. J Immunol. 2015 Aug 1;195(3):965-72. doi: 10.4049/jimmunol.1500591. Epub 2015 Jun 19.
- Ietto G, Mortara L, Dalla Gasperina D, Iovino D, Azzi L, Baj A, Ageno W, Genoni AP, Acquati F, Gallazzi M, Spina G, Coco G, Pierin F, Noonan D, Vigezzi A, Monti E, Iori V, Masci F, Franchi C, Di Saverio S, Carcano G. Immune-Mediated Mechanisms in Patients Testing Positive for SARS-CoV-2: Protocol for a Multianalysis Study. JMIR Res Protoc. 2022 Jan 25;11(1):e29892. doi: 10.2196/29892.
Tanulmányi rekorddátumok
Tanulmány főbb dátumok
Tanulmány kezdete (Tényleges)
Elsődleges befejezés (Várható)
A tanulmány befejezése (Várható)
Tanulmányi regisztráció dátumai
Először benyújtva
Először nyújtották be, amely megfelel a minőségbiztosítási kritériumoknak
Első közzététel (Tényleges)
Tanulmányi rekordok frissítései
Utolsó frissítés közzétéve (Tényleges)
Az utolsó frissítés elküldve, amely megfelel a minőségbiztosítási kritériumoknak
Utolsó ellenőrzés
Több információ
A tanulmányhoz kapcsolódó kifejezések
További vonatkozó MeSH feltételek
Egyéb vizsgálati azonosító számok
- 67/2020
Terv az egyéni résztvevői adatokhoz (IPD)
Tervezi megosztani az egyéni résztvevői adatokat (IPD)?
Gyógyszer- és eszközinformációk, tanulmányi dokumentumok
Egy amerikai FDA által szabályozott gyógyszerkészítményt tanulmányoz
Egy amerikai FDA által szabályozott eszközterméket tanulmányoz
Ezt az információt közvetlenül a clinicaltrials.gov webhelyről szereztük be, változtatás nélkül. Ha bármilyen kérése van vizsgálati adatainak módosítására, eltávolítására vagy frissítésére, kérjük, írjon a következő címre: register@clinicaltrials.gov. Amint a változás bevezetésre kerül a clinicaltrials.gov oldalon, ez a webhelyünkön is automatikusan frissül. .