Activité des monocytes et des cellules NK chez les patients atteints de Covid-19

Selon l'hypothèse médicale sur laquelle repose le protocole, les jeunes pourraient bénéficier d'une adaptation fonctionnelle des cellules immunitaires innées induite par la reprogrammation épigénétique et, surtout, d'une immunité préexistante "partiellement spécifique" aux virus communautaires causés par des "bystander effet" des vaccinations précédentes. Dans cette étude, nous explorerons les principales différences existant entre les patients infectés par le SRAS-CoV-2 qui souffrent de la maladie à différents degrés de gravité. Nous supposons reconnaître différentes populations de patients, chacune avec un profil immunologique spécifique. Il pourrait différer en termes de cytokines, de taux sériques de facteurs solubles et d'activité des cellules immunitaires à la fois du compartiment inné et du compartiment acquis.

Les données seront collectées selon 3 approches :

• Une analyse expérimentale, par grappes de patients, pour étudier la réponse immunitaire innée et identifier les profils génétiques.
• Une analyse épidémiologique, afin d'identifier les antécédents vaccinaux des patients ;
• Une analyse clinique, pour détecter le profil immunologique ;

Pour l'analyse spécifique, afin d'étudier la réponse immunitaire innée et d'identifier les profils génétiques, les scientifiques analyseront, à partir du sang périphérique, des cellules NK, des monocytes, des cellules T CD4 et CD8 des deux groupes : des patients sains (testés négatifs pour le SRAS-CoV -2) et malades des sous-groupes (AS 19, PAU19, POL19, ARD19).

De différents groupes de patients, des échantillons de sang (10-15 mL) seront prélevés dans des tubes EDTA, centrifugés à 360 g pendant 10 minutes pour obtenir du plasma qui sera conservé à -80°C pour une analyse ultérieure des cytokines et chimiokines d'intérêt par ELISA (IL-1b, IL-6, TNF, IFN-a, IL-10, IL-12, CCL2 et CXCL10) en fin d'inscription.

Les culots cellulaires seront ramenés au volume initial avec du PBS et dilués 1:1 (v/v), puis soumis à une stratification en gradient de densité avec du Ficoll Histopaque-1077, à 500 g pendant 30 minutes. Les cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) dérivées de l'anneau blanc seront collectées, lavées deux fois dans du PBS, puis utilisées pour des expériences ultérieures à l'aide d'un test de cytomètre en flux (REFF). La culture in vitro à l'aide de PBMC peut varier d'ex vivo 1 jour à quelques jours, et les cellules seront maintenues dans du milieu RPMI 1640, additionné de 10 % de sérum bovin fœtal (FBS), 2 mM de l-glutamine, 100 U/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine (P/S), à 37°C, 5% CO2.

Pour effectuer une analyse de phénotype ex vivo par trieur de cellules activées par fluorescence (FACS), 2,5 x 105 de PBMC totaux frais par tube FACS seront colorés pendant 30 minutes à 4 ° C avec des anticorps monoclonaux (mAbs) comme suit : CD3-PerCP, CD56-APC , CD16-FITC, NKG2A-PE, NKG2C-PE, NKGD2-PE, DNAM-1-PE, CD25-PE, CD69-PE. Après le réglage Forward/Side Scatter, les cellules NK seront identifiées en deux sous-ensembles de cellules, c'est-à-dire en tant que cellules CD3- et CD56dim CD16+ (cellules CD56dim NK, le sous-ensemble principal, environ 90 %), et cellules CD3- et CD56bright CD16-/low ( Cellules NK CD56bright, le sous-ensemble mineur, environ 10 %). L'expression d'autres marqueurs sera évaluée sur les deux sous-ensembles de cellules fermées.

Pour l'évaluation FACS ex vivo de l'analyse du phénotype des monocytes, 2,5x105 de PBMC totaux frais par tube FACS seront colorés pendant 30 minutes à 4 ° C avec des mAb comme suit : CD45-APC, CD14-FITC et CD16-V450, PE-CD209, PE-CD80. Après le réglage Forward/Side Scatter, les monocytes seront identifiés en trois sous-ensembles, c'est-à-dire en tant que cellules CD14+ et CD16- (le sous-ensemble principal, environ 90 %), CD14+ CD16+ (le sous-ensemble mineur, environ 10 %) et CD14-/low CD16+ (l'autre sous-ensemble mineur).

Nous évaluerons également le phénotype des cellules T CD4 et CD8 et le rapport T CD4/CD8 en utilisant 2x105 de PBMC totaux frais, comme décrit précédemment, avec les mAb suivants : CD3-PerCP, CD4-APC, CD8-V450 ainsi que T régulateur (Treg ) cellules, comme CD3-PerCP, CD4-APC, CD25-PE.

Les PBMC seront également stimulés in vitro pendant 4 h avec différents types de stimuli, tels que LPS (reconnu par le TLR4), poly(I:C) (reconnu par le TLR3), poly (I:C) plus IL-2 plus IL-12 et acétate de myristate de phorbol (PMA) plus ionomycine en présence de monensine et de brefeldine. Cette procédure permettra d'étudier la production spécifique de cytokines/chimiokines à partir de cellules NK et de monocytes en utilisant un test intracellulaire FACS, comme décrit précédemment (REFF). Pour les cellules NK, nous mesurerons IFN-a-PE, TNF-PE, CCL2-PE, CXCL10-PE et CD107a-PE (marqueur de dégranulation). Pour les monocytes nous étudierons : IL-6-PE, TNFa-PE, IL-12-PE, CXCL10-PE (marqueurs pro-inflammatoires de type M1) et TGFb-PE, IL-10-PE, CCL18-PE (M2 -type marqueurs anti-inflammatoires) Chaque fois que la quantité de PBMCs sera suffisante, d'autres tests fonctionnels in vitro sur cellules NK et monocytes seront mis en place. En particulier, les PBMC seront étudiés pour la dégranulation/fonction cytotoxique des cellules NK pendant 4 h vis-à-vis de la lignée cellulaire érytroleucémique K562 en évaluant la surface CD107a-PE à l'aide d'un dosage cytofluorimétrique en flux (REFF).

Chaque fois que la quantité de PBMC est suffisante, les monocytes seront purifiés à l'aide de microbilles anti-CD14 avec séparateur magnétique et de cellules NK avec le kit RosetteSep pour obtenir > 90 % de populations de cellules purifiées.

Les monocytes purifiés et les NK purifiés pourraient être maintenus séparés ou ensemble en culture en utilisant du milieu RPMI 1640 avec 10 % de FBS, et complétés avec du M-CSF et de l'IL-2, respectivement, stimulés avec différents stimuli (voir ci-dessus), puis vérifiés pour les cytokines intracellulaires /chimiokines d'intérêt (voir ci-dessus). En même temps, les surnageants (milieu conditionné, CM) pourraient être récoltés à la fin de la culture d'incubation in vitro et évalués pour les cytokines/chimiokines en utilisant ELISA (IL-1b, IL-6, TNFa, IFNa, IL-10, IL- 12, CXCL10).

La culture in vitro de monocytes de 4 à 5 jours sera encore stimulée 24 h avec LPS plus IFNg (stimulus M1) ou (IL-4) (stimulus M2) pour étudier la polarisation des macrophages en étudiant les marqueurs M1 de surface (TNF, CXCL10) ou les marqueurs M2 (IL-10, CCL18) pour vérifier la prévalence de la polarisation des macrophages dans différents groupes de patients Covid-19.

L'analyse épidémiologique sera réalisée en intégrant à la fois les antécédents vaccinaux et les données recueillies quotidiennement après l'hospitalisation. Les archives d'ATS Insubria fourniront les données manquantes.

Compte tenu du profil immunologique, les patients atteints de Covid-19 seront testés pour les examens de routine et les suivants :

• immunophénotypage lymphocytaire;
• détermination de l'activité des fractions du complément C3 et C4 ;
• taux sérique d'immunoglobuline (IgG, IgM, IgA, IgE);
• électrophorèse des protéines sériques;
• taux sérique de l'enzyme de conversion de l'angiotensine (ACE);
• Test sérologique CMV (Citomegalovirus) ;
• Taux sérique d'IL-6.