Covid-19 患者的单核细胞和 NK 细胞活性
SARS-CoV-2 检测呈阳性的患者的免疫介导机制研究：受 Covid 19 影响的受试者血液中单核细胞和 NK 细胞的表型和功能分析
SARS-CoV-2 属于β-冠状病毒家族，其传播途径和症状与所有社区获得性冠状病毒相同。 新型冠状病毒的主要区别是死亡率较高，约为 3%。
只有 50 岁以上的患者死亡率超过 1%，而 40 岁之前的死亡率低于 0.4%。 迄今为止，没有 10 岁以下儿童死亡的消息。 男性的死亡率几乎是女性的两倍。 这种根据感染患者年龄的死亡率分布，除了年龄大外，只能部分归因于其他合并症。 事实上，没有既往病史的患者的病死率为 0.9%。
儿童和 40 岁以下患者的重病率几乎为零，这是非常令人费解的。 婴儿、儿童和青少年可能被感染，但感染会迅速自限或无症状。 由于迟到的免疫反应，老年患者会遭受严重的肺损伤。
这些现象的可能解释可能是某种东西，它确保年轻人能够独立于病毒本身的新颖性而迅速对 SARS-CoV-2 做出反应。
似乎年轻人在没有事先接触的情况下已经对病毒抗原敏感。
这种免疫力并不是真正的特异性，而是对病毒的许多抗原“部分特异性”，但能够限制生物体的感染。 有些东西刺激了免疫系统，它分散了对越来越多存在的抗原的免疫力。 儿童是最容易接触所有社区传播病毒的年龄组。
这种免疫力不是持久的，而是逐渐消失的。 它从两岁开始保护，当假设的刺激发生时，到第五个十年，因为它缓慢下降。
健康人接受的唯一外部刺激是疫苗。 所有疫苗接种，尤其是破伤风、白喉类毒素和百日咳等灭活细菌都可以刺激免疫系统。 它们会产生特异性免疫力，但也会产生针对运输途中的抗原（如冠状病毒和其他社区传播病毒）的萌芽免疫力。
发达的免疫力可以在数年内针对多种病毒感染提供一定的保护，直到自然消退。
在第五个十年之后，这种免疫力被召回和重新激活的速度变慢了。 此外，免疫系统受到抑制的移植受者和 HIV 感染患者出乎意料地似乎没有遭受 SARS-CoV-2 感染最严重的并发症。 免疫系统失衡可能在对病毒的反应中发挥关键作用，限制过度炎症的破坏性后果。
根据该协议所基于的医学假设，年轻人可以受益于通过表观遗传重编程诱导的先天免疫细胞的功能适应，尤其是对由“旁观者”引起的社区病毒的预先存在的“部分特异性”免疫之前接种疫苗的效果”。 在这项研究中，我们将探讨在不同严重程度的 SARS-CoV-2 感染患者中存在的主要差异。 我们假设识别不同的患者群体，每个患者都有特定的免疫模式。 它可能在细胞因子、可溶性因子血清水平和先天隔室和后天隔室的免疫细胞活性方面有所不同。 这些免疫学现象在 Covid-19 发病机制中的作用的证据是实施治疗性免疫调节治疗的基础。 此外，免疫学风险概况的定义可以为每种患者量身定制既定疗法。
研究概览
详细说明
根据该协议所基于的医学假设，年轻人可以受益于通过表观遗传重编程诱导的先天免疫细胞的功能适应，尤其是对由“旁观者”引起的社区病毒的预先存在的“部分特异性”免疫之前接种疫苗的效果”。 在这项研究中，我们将探讨在不同严重程度的 SARS-CoV-2 感染患者中存在的主要差异。 我们假设识别不同的患者群体，每个患者都有特定的免疫模式。 它可能在细胞因子、可溶性因子血清水平和先天隔室和后天隔室的免疫细胞活性方面有所不同。
将使用 3 种方法收集数据：
- 一项针对患者群的实验分析，以研究先天免疫反应并确定遗传概况。
- 流行病学分析，以确定患者的疫苗接种史；
- 临床分析，检测免疫学特征；
为了具体分析，为了研究先天免疫反应并确定遗传图谱，科学家将从外周血、NK 细胞、单核细胞、CD4 和 CD8 T 细胞中分析两组：健康患者（SARS-CoV 检测呈阴性-2) 和亚组的患病患者 (AS 19、PAU19、POL19、ARD19)。
将来自不同患者组的血液样本（10-15 mL）吸入 EDTA 管中，以 360 g 离心 10 分钟以获得血浆，将其储存在 -80°C 下用于后续分析细胞因子和感兴趣的趋化因子在登记结束时通过 ELISA（IL-1b、IL-6、TNF、IFN-a、IL-10、IL-12、CCL2 和 CXCL10）。
细胞沉淀将用 PBS 恢复到初始体积并按 1:1 (v/v) 稀释，然后用 Ficoll Histopaque-1077 在 500 g 下进行密度梯度分层 30 分钟。 来自白环的外周血单核细胞 (PBMC) 将被收集，在 PBS 中洗涤两次，然后使用流式细胞仪测定 (REFF) 用于后续实验。 使用 PBMC 的体外培养可以从离体 1 天到几天不等，细胞将维持在 RPMI 1640 培养基中，补充有 10% 胎牛血清 (FBS)、2 mM l-谷氨酰胺、100 U/mL 青霉素和 100 μg/mL 链霉素 (P/S)，37°C，5% CO2。
为了进行离体荧光激活细胞分选仪 (FACS) 表型分析，每个 FACS 管中的 2.5x105 新鲜总 PBMC 将在 4°C 下用单克隆抗体 (mAb) 染色 30 分钟，如下所示：CD3-PerCP、CD56-APC , CD16-FITC, NKG2A-PE, NKG2C-PE, NKGD2-PE, DNAM-1-PE, CD25-PE, CD69-PE。 按照 Forward/Side Scatter 设置，NK 细胞将被识别为两个细胞亚群，即 CD3- 和 CD56dim CD16+ 细胞（CD56dim NK 细胞，主要亚群，约占 90%），以及 CD3- 和 CD56bright CD16-/low 细胞（ CD56bright NK 细胞，次要子集，约 10%）。 其他标记表达将在门控细胞的两个子集上进行评估。
对于单核细胞表型分析的离体 FACS 评估，每个 FACS 管的 2.5x105 新鲜总 PBMC 将在 4°C 下用 mAb 染色 30 分钟，如下所示：CD45-APC、CD14-FITC 和 CD16-V450、PE-CD209、 PE-CD80。 按照 Forward/Side Scatter 设置，单核细胞将被识别为三个子集，即 CD14+ 和 CD16- 细胞（主要子集，约 90%）、CD14+ CD16+（次要子集，约 10%）和 CD14-/低 CD16+ （另一个小子集）。
我们还将使用 2x105 的新鲜总 PBMC 评估 CD4 和 CD8 T 细胞的表型和 CD4/CD8 T 比率，如前所述，使用以下 mAb：CD3-PerCP、CD4-APC、CD8-V450 以及 T 调节（Treg ) 细胞，如 CD3-PerCP、CD4-APC、CD25-PE。
PBMC 也将在体外用不同类型的刺激物刺激 4 小时，例如 LPS（由 TLR4 识别）、poly(I:C)（由 TLR3 识别）、poly(I:C) 加 IL-2 加在存在莫能菌素和布雷菲德菌素的情况下，IL-12 和佛波醇肉豆蔻酸酯醋酸酯 (PMA) 加离子霉素。 该程序将允许通过使用 FACS 细胞内测定研究 NK 细胞和单核细胞的特定细胞因子/趋化因子的产生，如前所述 (REFF)。 对于 NK 细胞，我们将测量 IFN-a-PE、TNF-PE、CCL2-PE、CXCL10-PE 和 CD107a-PE（脱颗粒标记）。 对于单核细胞，我们将研究：IL-6-PE、TNFa-PE、IL-12-PE、CXCL10-PE（M1 型促炎标志物）和 TGFb-PE、IL-10-PE、CCL18-PE（M2型抗炎标志物）当PBMC数量充足时，再设置NK细胞和单核细胞等体外功能检测。 特别是，将使用流式细胞荧光测定 (REFF) 研究 PBMC 4 小时 NK 细胞脱粒/细胞毒性功能对红白血病 K562 细胞系的评估表面 CD107a-PE。
只要 PBMC 的数量足够，单核细胞将使用带有磁性分离器的抗 CD14 微珠和带有 RosetteSep 套件的 NK 细胞进行纯化，以获得 >90% 的纯化细胞群。
使用含有 10% FBS 的 RPMI 1640 培养基，分别补充 M-CSF 和 IL-2，用不同的刺激物刺激（见上文），然后检查细胞内细胞因子，纯化的单核细胞和纯化的 NK 可以保持分离或一起培养/感兴趣的趋化因子（见上文）。 同时，可以在体外孵育培养结束时收获上清液（条件培养基，CM）并使用 ELISA（IL-1b、IL-6、TNFa、IFNa、IL-10、IL- 12，CXCL10）。
体外培养 4-5 天的单核细胞将用 LPS 加 IFNg（M1 刺激）或（IL-4）（M2 刺激）进一步刺激 24 小时，以研究巨噬细胞极化研究表面 M1 标记（TNF、CXCL10）或 M2 标记(IL-10, CCL18) 检查不同 Covid-19 患者群体中巨噬细胞极化的流行程度。
流行病学分析将结合疫苗接种史和入院后每天收集的数据进行。 ATS Insubria 档案将提供缺失的数据。
考虑到免疫学特征，将对 Covid-19 患者进行常规检查和以下检查：
- 淋巴细胞免疫分型；
- C3 和 C4 补体组分活性的测定；
- 免疫球蛋白（IgG、IgM、IgA、IgE）血清水平；
- 血清蛋白电泳；
- 血管紧张素转换酶 (ACE) 血清水平；
- CMV（巨细胞病毒）血清学检测；
- IL-6 血清水平。
研究类型
注册 (预期的)
联系人和位置
学习地点
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-
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Varese、意大利、21100
- 招聘中
- ATS Insubria
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接触：
- Giuseppe Ietto, M.D.
- 电话号码：+393398758024
- 邮箱：giuseppe.ietto@gmail.com
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首席研究员：
- Giuseppe Ietto, MD
-
首席研究员：
- Lorenzo Mortara, Professor
-
副研究员：
- Domenico Iovino, MD
-
副研究员：
- Daniela Dalla Gasperina, Professor
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首席研究员：
- Giulio Carcano, Professor
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副研究员：
- Andreina Baj, MD
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副研究员：
- Walter Ageno, Professor
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副研究员：
- Francesco Acquati, Professor
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副研究员：
- Angelo Genoni, Dr
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副研究员：
- Denisa Baci, PhD
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副研究员：
- Matteo Gallazzi, PhD
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副研究员：
- Annarosaria De Vito, PhD
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副研究员：
- Elisa Monti, MD
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副研究员：
- Andrea Vigezzi, MD
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副研究员：
- Caterina Franchi, MD
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副研究员：
- Valentina Iori, MD
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副研究员：
- Federica Masci, MD
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参与标准
资格标准
适合学习的年龄
接受健康志愿者
有资格学习的性别
取样方法
研究人群
描述
纳入标准：
- 年龄：≥18
- SARS-CoV-2 记录的感染
排除标准：
- 拒绝签署协议（知情同意）；
- 无法签署协议；
- HIV、HCV、HBV（HBsAg 阳性）感染。
学习计划
研究是如何设计的？
设计细节
- 观测模型：仅案例
- 时间观点：预期
队列和干预
团体/队列 |
干预/治疗 |
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SARS-CoV-2 检测呈阳性
SARS-CoV-2 检测呈阳性的患者将被招募到瓦雷泽“Ospedale Di Circolo - ASST Settelaghi”教学医院的急诊室。
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单核细胞和 NK 细胞的表型和功能分析
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研究衡量的是什么？
主要结果指标
结果测量 |
措施说明 |
大体时间 |
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免疫细胞活性
大体时间：6个月
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科学家的假设是，在严重感染 SARS-CoV-2 的患者中，单核细胞、NK、CD4 和 CD8 T 细胞显示出功能受损：细胞表现出过度活跃，引发病理性炎症反应，大量产生促炎细胞因子、水肿和肺纤维化。
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6个月
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次要结果测量
结果测量 |
措施说明 |
大体时间 |
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保护因素和新的治疗策略
大体时间：6个月
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次要目标是将临床数据和疫苗接种史与实验室免疫模式相关联，以确定 Covid 19 的保护因素，并为新的治疗策略开辟道路。
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6个月
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合作者和调查者
调查人员
- 学习椅：Giulio Carcano, Professor、Università degli Studi dell'Insubria
- 首席研究员：Giuseppe Ietto, M.D.、Università degli Studi dell'Insubria
- 首席研究员：Lorenzo Mortara, Professor、Università degli Studi dell'Insubria
出版物和有用的链接
一般刊物
- Netea MG, Dominguez-Andres J, Barreiro LB, Chavakis T, Divangahi M, Fuchs E, Joosten LAB, van der Meer JWM, Mhlanga MM, Mulder WJM, Riksen NP, Schlitzer A, Schultze JL, Stabell Benn C, Sun JC, Xavier RJ, Latz E. Defining trained immunity and its role in health and disease. Nat Rev Immunol. 2020 Jun;20(6):375-388. doi: 10.1038/s41577-020-0285-6. Epub 2020 Mar 4.
- Benn CS, Netea MG, Selin LK, Aaby P. A small jab - a big effect: nonspecific immunomodulation by vaccines. Trends Immunol. 2013 Sep;34(9):431-9. doi: 10.1016/j.it.2013.04.004. Epub 2013 May 14.
- Ietto G. SARS - CoV-2: Reasons of epidemiology of severe ill disease cases and therapeutic approach using trivalent vaccine (tetanus, diphtheria and Bordetella pertussis). Med Hypotheses. 2020 Aug;141:109779. doi: 10.1016/j.mehy.2020.109779. Epub 2020 Apr 22.
- Murray PJ, Allen JE, Biswas SK, Fisher EA, Gilroy DW, Goerdt S, Gordon S, Hamilton JA, Ivashkiv LB, Lawrence T, Locati M, Mantovani A, Martinez FO, Mege JL, Mosser DM, Natoli G, Saeij JP, Schultze JL, Shirey KA, Sica A, Suttles J, Udalova I, van Ginderachter JA, Vogel SN, Wynn TA. Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 2014 Jul 17;41(1):14-20. doi: 10.1016/j.immuni.2014.06.008.
- Noonan DM, De Lerma Barbaro A, Vannini N, Mortara L, Albini A. Inflammation, inflammatory cells and angiogenesis: decisions and indecisions. Cancer Metastasis Rev. 2008 Mar;27(1):31-40. doi: 10.1007/s10555-007-9108-5.
- Parisi L, Gini E, Baci D, Tremolati M, Fanuli M, Bassani B, Farronato G, Bruno A, Mortara L. Macrophage Polarization in Chronic Inflammatory Diseases: Killers or Builders? J Immunol Res. 2018 Jan 14;2018:8917804. doi: 10.1155/2018/8917804. eCollection 2018.
- Bruno A, Focaccetti C, Pagani A, Imperatori AS, Spagnoletti M, Rotolo N, Cantelmo AR, Franzi F, Capella C, Ferlazzo G, Mortara L, Albini A, Noonan DM. The proangiogenic phenotype of natural killer cells in patients with non-small cell lung cancer. Neoplasia. 2013 Feb;15(2):133-42. doi: 10.1593/neo.121758.
- Bruno A, Bassani B, D'Urso DG, Pitaku I, Cassinotti E, Pelosi G, Boni L, Dominioni L, Noonan DM, Mortara L, Albini A. Angiogenin and the MMP9-TIMP2 axis are up-regulated in proangiogenic, decidual NK-like cells from patients with colorectal cancer. FASEB J. 2018 Oct;32(10):5365-5377. doi: 10.1096/fj.201701103R. Epub 2018 May 15.
- Bassani B, Baci D, Gallazzi M, Poggi A, Bruno A, Mortara L. Natural Killer Cells as Key Players of Tumor Progression and Angiogenesis: Old and Novel Tools to Divert Their Pro-Tumor Activities into Potent Anti-Tumor Effects. Cancers (Basel). 2019 Apr 1;11(4):461. doi: 10.3390/cancers11040461.
- Morandi F, Horenstein AL, Chillemi A, Quarona V, Chiesa S, Imperatori A, Zanellato S, Mortara L, Gattorno M, Pistoia V, Malavasi F. CD56brightCD16- NK Cells Produce Adenosine through a CD38-Mediated Pathway and Act as Regulatory Cells Inhibiting Autologous CD4+ T Cell Proliferation. J Immunol. 2015 Aug 1;195(3):965-72. doi: 10.4049/jimmunol.1500591. Epub 2015 Jun 19.
- Ietto G, Mortara L, Dalla Gasperina D, Iovino D, Azzi L, Baj A, Ageno W, Genoni AP, Acquati F, Gallazzi M, Spina G, Coco G, Pierin F, Noonan D, Vigezzi A, Monti E, Iori V, Masci F, Franchi C, Di Saverio S, Carcano G. Immune-Mediated Mechanisms in Patients Testing Positive for SARS-CoV-2: Protocol for a Multianalysis Study. JMIR Res Protoc. 2022 Jan 25;11(1):e29892. doi: 10.2196/29892.
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研究主要日期
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研究完成 (预期的)
研究注册日期
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