Monocytter og NK-celleaktivitet hos Covid-19-pasienter
Studie av immunmedierte mekanismer hos pasienter testet positive for SARS-CoV-2: Fenotypisk og funksjonell analyse av monocytter og NK-celler i blodet til personer berørt av Covid 19
SARS-CoV-2 tilhører beta-coronavirus-familien og dens overføringsvei, og symptomene følger de til alle samfunnservervede koronavirus. Hovedforskjellen til det nye koronaviruset er den høyere dødeligheten, det vil si rundt 3 %.
Dødsraten er over 1 % bare for pasienter over 50 år, mens inntil 40 år er under 0,4 %. Ingen omkomne er rapportert blant barn under 10 år til dags dato. Dødsraten er nesten dobbelt for menn i stedet for kvinner. Denne fordelingen av dødelighet i henhold til alder på infiserte pasienter kunne bare delvis tilskrives andre komorbiditeter i tillegg til høy alder. Faktisk har pasienter uten eksisterende forhold imidlertid en dødsrate på 0,9 %.
Den nesten nullgraden av alvorlig sykdom hos barn og generelt hos pasienter yngre enn 40 år er ganske uforklarlig. Spedbarn, barn og unge kan bli smittet, men infeksjonen er raskt selvbegrensende eller uten symptomer. Eldre pasienter får alvorlig lungeskade som følge av en immunrespons som kommer sent.
Mulig forklaring på disse fenomenene kan være noe som sikrer evnen til å gi rask respons på SARS-CoV-2 hos yngre mennesker uavhengig av nyheten til viruset i seg selv.
Det ser ut til å være at yngre mennesker allerede er sensibilisert for antigenene til viruset uten tidligere kontakt.
Denne immuniteten er egentlig ikke spesifikk, men "delvis spesifikk" for mange antigener av viruset, men i stand til å begrense infeksjonen i organismen. Noe stimulerte immunsystemet og det spredte immunitet mot flere og flere antigener tilstede. Barn er den aldersgruppen som for det meste er utsatt for alle samfunnssirkulerende virus.
Denne immuniteten er ikke vedvarende, men forsvinner gradvis. Den beskytter fra toårsalderen, når den hypotetiske stimuleringen skjer, til det femte tiåret på grunn av dens sakte nedgang.
Den eneste ytre stimuleringen som friske mennesker får er vaksiner. Alle vaksinasjoner og spesielt tetaniske, difteritoksoider og inaktiverte bakterier som kikhoste kan stimulere immunsystemet. De utvikler den spesifikke immuniteten, men genererer også en spirende immunitet mot antigener i transitt, som koronavirus og andre samfunnssirkulerende virus.
Den utviklede immuniteten gir en viss beskyttelse mot flere virusinfeksjoner i årevis inntil den naturlige falmer ut.
Etter det femte tiåret er denne immuniteten tregere til å bli tilbakekalt og reaktivert. I tillegg ser det ikke uventet ut til at transplanterte og HIV-infiserte pasienter, som har et hemmet immunsystem, lider av de verste komplikasjonene av SARS-CoV-2-infeksjon. En ubalanse i immunsystemet kan spille en sentral rolle under reaksjonen på viruset, og begrense destruktive konsekvenser av overdreven betennelse.
I henhold til den medisinske hypotesen som protokollen er basert på, kan unge mennesker dra nytte av en funksjonell tilpasning av medfødte immunceller indusert gjennom epigenetisk omprogrammering og spesielt en allerede eksisterende "delvis spesifikk" immunitet mot samfunnsvirusene forårsaket av "tilskuere". effekt" av tidligere vaksinasjoner. I denne studien vil vi utforske de viktigste forskjellene som eksisterer blant pasienter infisert av SARS-CoV-2 som opplever sykdommen med ulik alvorlighetsgrad. Vi antar å gjenkjenne forskjellige populasjoner av pasienter, hver med et spesifikt immunologisk mønster. Det kan variere når det gjelder cytokiner, løselige faktorers serumnivå og immuncelleaktivitet både i det medfødte og det ervervede. Beviset på en rolle av disse immunologiske fenomenene i patogenesen av Covid-19 er baser for implementering av terapeutiske immunmodulerende behandlinger. I tillegg kan definisjonen av en immunologisk risikoprofil skreddersy etablerte terapier til hver type pasient.
Studieoversikt
Status
Intervensjon / Behandling
Detaljert beskrivelse
I henhold til den medisinske hypotesen som protokollen er basert på, kan unge mennesker dra nytte av en funksjonell tilpasning av medfødte immunceller indusert gjennom epigenetisk omprogrammering og spesielt en allerede eksisterende "delvis spesifikk" immunitet mot samfunnsvirusene forårsaket av "tilskuere". effekt" av tidligere vaksinasjoner. I denne studien vil vi utforske de viktigste forskjellene som eksisterer blant pasienter infisert av SARS-CoV-2 som opplever sykdommen med ulik alvorlighetsgrad. Vi antar å gjenkjenne forskjellige populasjoner av pasienter, hver med et spesifikt immunologisk mønster. Det kan variere når det gjelder cytokiner, løselige faktorers serumnivå og immuncelleaktivitet både i det medfødte og det ervervede.
Data vil bli samlet inn ved hjelp av 3 tilnærminger:
- En eksperimentell analyse, for klynger av pasienter, for å studere den medfødte immunresponsen og identifisere de genetiske profilene.
- En epidemiologisk analyse, for å identifisere pasientenes vaksinasjonshistorie;
- En klinisk analyse for å oppdage den immunologiske profilen;
For den spesifikke analysen, for å studere den medfødte immunresponsen og for å identifisere de genetiske profilene, vil forskere analysere, fra det perifere blodet, NK-celler, monocytter, CD4 og CD8 T-celler fra begge grupper: friske pasienter (testet negativt for SARS-CoV -2) og syke pasienter i undergruppene (AS 19, PAU19, POL19, ARD19).
Fra forskjellige grupper av pasienter vil blodprøver (10-15 ml) bli trukket inn i EDTA-rør, sentrifugert ved 360 g i 10 minutter for å oppnå plasma som vil bli lagret ved -80 °C for påfølgende analyse for cytokiner og kjemokiner av interesse. ved ELISA (IL-1b, IL-6, TNF, IFN-a, IL-10, IL-12, CCL2 og CXCL10) ved slutten av registreringen.
Cellepelletene vil bli brakt tilbake til det opprinnelige volumet med PBS og fortynnet 1:1 (v/v), og deretter utsatt for en tetthetsgradientstratifisering med Ficoll Histopaque-1077, ved 500 g i 30 minutter. De perifere blodmononukleære cellene (PBMCs) avledet fra den hvite ringen vil bli samlet, vasket to ganger i PBS, og deretter brukt til påfølgende eksperimenter ved bruk av en flowcytometer-analyse (REFF). In vitro-kulturen ved bruk av PBMC-er kan variere fra ex vivo 1 dag til noen få dager, og cellene opprettholdes i RPMI 1640-medium, supplert med 10 % føtalt bovint serum (FBS), 2 mM l-glutamin, 100 U/mL penicillin og 100 μg/mL streptomycin (P/S), ved 37°C, 5 % CO2.
For å utføre ex vivo fluorescensaktivert cellesorterer (FACS) fenotypeanalyse, vil 2,5x105 av ferske totale PBMCer per FACS-rør farges i 30 minutter ved 4°C med monoklonale antistoffer (mAbs) som følger: CD3-PerCP, CD56-APC , CD16-FITC, NKG2A-PE, NKG2C-PE, NKGD2-PE, DNAM-1-PE, CD25-PE, CD69-PE. Etter Forward/Side Scatter-innstilling vil NK-celler bli identifisert i to celleundersett, dvs. som CD3- og CD56dim CD16+-celler (CD56dim NK-celler, hovedundergruppen, ca. 90%), og CD3- og CD56bright CD16-/lav-celler ( CD56bright NK-celler, den mindre undergruppen, omtrent 10 %). Andre markøruttrykk vil bli evaluert på begge undergruppene av gatede celler.
For ex vivo FACS-evaluering av monocytter-fenotypeanalyse, vil 2,5x105 av ferske totale PBMCer per FACS-rør farges i 30 minutter ved 4°C med mAbs som følger: CD45-APC, CD14-FITC og CD16-V450, PE-CD209, PE-CD80. Etter Forward/Side Scatter-innstilling vil monocytter bli identifisert i tre delsett, dvs. som CD14+ og CD16- celler (hovedundergruppen, ca. 90%), CD14+ CD16+ (den mindre delmengden, ca. 10%), og CD14-/lav CD16+ (den andre mindre delmengden).
Vi vil også evaluere fenotype for CD4 og CD8 T-celler og CD4/CD8 T-forhold ved å bruke 2x105 av ferske totale PBMC-er, som tidligere beskrevet, med følgende mAbs: CD3-PerCP, CD4-APC, CD8-V450 samt T-regulatoriske (Treg) ) celler, som CD3-PerCP, CD4-APC, CD25-PE.
PBMC-er vil også bli stimulert in vitro i 4 timer med forskjellige typer stimuli, slik som LPS (gjenkjent av TLR4), poly(I:C) (gjenkjent av TLR3), poly (I:C) pluss IL-2 pluss IL-12 og forbolmyristatacetat (PMA) pluss ionomycin i nærvær av monensin og brefeldin. Denne prosedyren vil tillate å studere spesifikk cytokin/kjemokinproduksjon fra NK-celler og monocytter ved å bruke en FACS intracellulær analyse, som beskrevet tidligere (REFF). For NK-celler vil vi måle IFN-a-PE, TNF-PE, CCL2-PE, CXCL10-PE og CD107a-PE (degranuleringsmarkør). For monocytter vil vi undersøke: IL-6-PE, TNFa-PE, IL-12-PE, CXCL10-PE (M1-type pro-inflammatoriske markører) og TGFb-PE, IL-10-PE, CCL18-PE (M2) -type antiinflammatoriske markører) Når mengden av PBMC er tilstrekkelig, vil andre funksjonelle in vitro-tester på NK-celler og monocytter settes opp. Spesielt vil PBMC-er bli studert for 4 timers NK-celledegranulering/cytotoksisk funksjon mot erytroleukemisk K562-cellelinje som vurderer overflate CD107a-PE ved bruk av en flowcytofluorimetrisk analyse (REFF).
Når mengden PBMC-er er tilstrekkelig, vil monocytter renses ved å bruke anti-CD14-mikrokuler med magnetisk separator og NK-celler med RosetteSep-sett for å oppnå >90 % rensede cellepopulasjoner.
Rensede monocytter og renset NK kunne holdes adskilt eller sammen i kultur ved bruk av RPMI 1640-medium med 10% FBS, og supplert med henholdsvis M-CSF og IL-2, stimulert med forskjellige stimuli (se ovenfor), og deretter sjekket for intracellulære cytokiner /kjemokiner av interesse (se ovenfor). Samtidig kunne supernatantene (kondisjonert medium, CM) høstes ved slutten av in vitro inkubasjonskultur og vurderes for cytokiner/kjemokiner ved bruk av ELISA (IL-1b, IL-6, TNFa, IFNa, IL-10, IL- 12, CXCL10).
De 4-5 dagene in vitro-kulturen av monocytter vil bli ytterligere stimulert 24 timer med LPS pluss IFNg (M1-stimulus) eller (IL-4) (M2-stimulus) for å undersøke makrofagpolarisering ved å studere overflate-M1-markører (TNF, CXCL10) eller M2-markører (IL-10, CCL18) for å sjekke forekomsten av makrofagpolarisering i forskjellige grupper av Covid-19-pasienter.
Den epidemiologiske analysen vil bli utført ved å integrere både vaksinasjonshistorikk og data som samles inn daglig etter sykehusinnleggelse. ATS Insubria-arkiver vil gi manglende data.
Med tanke på den immunologiske profilen vil pasienter med Covid-19 bli testet for rutineundersøkelser og følgende:
- lymfocytt immunfenotyping;
- bestemmelse av C3- og C4-komplementfraksjonsaktivitet;
- immunoglobulin (IgG, IgM, IgA, IgE) serumnivå;
- serumproteinelektroforese;
- Angiotensin Converting Enzyme (ACE) serumnivå;
- CMV (Citomegalovirus) serologitest;
- IL-6 serumnivå.
Studietype
Registrering (Forventet)
Kontakter og plasseringer
Studiesteder
-
-
-
Varese, Italia, 21100
- Rekruttering
- ATS Insubria
-
Ta kontakt med:
- Giuseppe Ietto, M.D.
- Telefonnummer: +393398758024
- E-post: giuseppe.ietto@gmail.com
-
Hovedetterforsker:
- Giuseppe Ietto, MD
-
Hovedetterforsker:
- Lorenzo Mortara, Professor
-
Underetterforsker:
- Domenico Iovino, MD
-
Underetterforsker:
- Daniela Dalla Gasperina, Professor
-
Hovedetterforsker:
- Giulio Carcano, Professor
-
Underetterforsker:
- Andreina Baj, MD
-
Underetterforsker:
- Walter Ageno, Professor
-
Underetterforsker:
- Francesco Acquati, Professor
-
Underetterforsker:
- Angelo Genoni, Dr
-
Underetterforsker:
- Denisa Baci, PhD
-
Underetterforsker:
- Matteo Gallazzi, PhD
-
Underetterforsker:
- Annarosaria De Vito, PhD
-
Underetterforsker:
- Elisa Monti, MD
-
Underetterforsker:
- Andrea Vigezzi, MD
-
Underetterforsker:
- Caterina Franchi, MD
-
Underetterforsker:
- Valentina Iori, MD
-
Underetterforsker:
- Federica Masci, MD
-
-
Deltakelseskriterier
Kvalifikasjonskriterier
Alder som er kvalifisert for studier
Tar imot friske frivillige
Kjønn som er kvalifisert for studier
Prøvetakingsmetode
Studiepopulasjon
Beskrivelse
Inklusjonskriterier:
- Alder: ≥ 18 år
- SARS-CoV-2 dokumentert infeksjon
Ekskluderingskriterier:
- Avslag på å signere avtalen (informert samtykke);
- manglende evne til å signere avtalen;
- HIV, HCV, HBV (positiv til HBsAg) infeksjon.
Studieplan
Hvordan er studiet utformet?
Designdetaljer
- Observasjonsmodeller: Bare etui
- Tidsperspektiver: Potensielle
Kohorter og intervensjoner
Gruppe / Kohort |
Intervensjon / Behandling |
|---|---|
|
Testet positivt for SARS-CoV-2
Pasienter, testet positive for SARS-CoV-2, vil bli rekruttert i E.R. av "Ospedale Di Circolo - ASST Settelaghi" Teaching Hospital i Varese.
|
Fenotypisk og funksjonell analyse av monocytter og NK-celler
|
Hva måler studien?
Primære resultatmål
Resultatmål |
Tiltaksbeskrivelse |
Tidsramme |
|---|---|---|
|
Aktivitet av immunceller
Tidsramme: 6 måneder
|
Forskernes hypotese er at monocytter, NK, CD4 OG CD8 T-celler, hos pasienter med alvorlig infeksjon mot SARS-CoV-2, viser en svekkelse i funksjonen: celler avslører en overveldende hyperaktivitet som provoserer en patologisk inflammatorisk respons med en massiv produksjon av proinflammatorisk cytokin, ødem og lungefibrose.
|
6 måneder
|
Sekundære resultatmål
Resultatmål |
Tiltaksbeskrivelse |
Tidsramme |
|---|---|---|
|
Beskyttende faktorer og nye terapeutiske strategier
Tidsramme: 6 måneder
|
De sekundære målene er å korrelere kliniske data og vaksinasjonshistorie med laboratorieimmunmønster for å identifisere beskyttende faktorer for Covid 19 og åpne veier for nye terapeutiske strategier.
|
6 måneder
|
Samarbeidspartnere og etterforskere
Etterforskere
- Studiestol: Giulio Carcano, Professor, Università degli Studi dell'Insubria
- Hovedetterforsker: Giuseppe Ietto, M.D., Università degli Studi dell'Insubria
- Hovedetterforsker: Lorenzo Mortara, Professor, Università degli Studi dell'Insubria
Publikasjoner og nyttige lenker
Generelle publikasjoner
- Netea MG, Dominguez-Andres J, Barreiro LB, Chavakis T, Divangahi M, Fuchs E, Joosten LAB, van der Meer JWM, Mhlanga MM, Mulder WJM, Riksen NP, Schlitzer A, Schultze JL, Stabell Benn C, Sun JC, Xavier RJ, Latz E. Defining trained immunity and its role in health and disease. Nat Rev Immunol. 2020 Jun;20(6):375-388. doi: 10.1038/s41577-020-0285-6. Epub 2020 Mar 4.
- Benn CS, Netea MG, Selin LK, Aaby P. A small jab - a big effect: nonspecific immunomodulation by vaccines. Trends Immunol. 2013 Sep;34(9):431-9. doi: 10.1016/j.it.2013.04.004. Epub 2013 May 14.
- Ietto G. SARS - CoV-2: Reasons of epidemiology of severe ill disease cases and therapeutic approach using trivalent vaccine (tetanus, diphtheria and Bordetella pertussis). Med Hypotheses. 2020 Aug;141:109779. doi: 10.1016/j.mehy.2020.109779. Epub 2020 Apr 22.
- Murray PJ, Allen JE, Biswas SK, Fisher EA, Gilroy DW, Goerdt S, Gordon S, Hamilton JA, Ivashkiv LB, Lawrence T, Locati M, Mantovani A, Martinez FO, Mege JL, Mosser DM, Natoli G, Saeij JP, Schultze JL, Shirey KA, Sica A, Suttles J, Udalova I, van Ginderachter JA, Vogel SN, Wynn TA. Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 2014 Jul 17;41(1):14-20. doi: 10.1016/j.immuni.2014.06.008.
- Noonan DM, De Lerma Barbaro A, Vannini N, Mortara L, Albini A. Inflammation, inflammatory cells and angiogenesis: decisions and indecisions. Cancer Metastasis Rev. 2008 Mar;27(1):31-40. doi: 10.1007/s10555-007-9108-5.
- Parisi L, Gini E, Baci D, Tremolati M, Fanuli M, Bassani B, Farronato G, Bruno A, Mortara L. Macrophage Polarization in Chronic Inflammatory Diseases: Killers or Builders? J Immunol Res. 2018 Jan 14;2018:8917804. doi: 10.1155/2018/8917804. eCollection 2018.
- Bruno A, Focaccetti C, Pagani A, Imperatori AS, Spagnoletti M, Rotolo N, Cantelmo AR, Franzi F, Capella C, Ferlazzo G, Mortara L, Albini A, Noonan DM. The proangiogenic phenotype of natural killer cells in patients with non-small cell lung cancer. Neoplasia. 2013 Feb;15(2):133-42. doi: 10.1593/neo.121758.
- Bruno A, Bassani B, D'Urso DG, Pitaku I, Cassinotti E, Pelosi G, Boni L, Dominioni L, Noonan DM, Mortara L, Albini A. Angiogenin and the MMP9-TIMP2 axis are up-regulated in proangiogenic, decidual NK-like cells from patients with colorectal cancer. FASEB J. 2018 Oct;32(10):5365-5377. doi: 10.1096/fj.201701103R. Epub 2018 May 15.
- Bassani B, Baci D, Gallazzi M, Poggi A, Bruno A, Mortara L. Natural Killer Cells as Key Players of Tumor Progression and Angiogenesis: Old and Novel Tools to Divert Their Pro-Tumor Activities into Potent Anti-Tumor Effects. Cancers (Basel). 2019 Apr 1;11(4):461. doi: 10.3390/cancers11040461.
- Morandi F, Horenstein AL, Chillemi A, Quarona V, Chiesa S, Imperatori A, Zanellato S, Mortara L, Gattorno M, Pistoia V, Malavasi F. CD56brightCD16- NK Cells Produce Adenosine through a CD38-Mediated Pathway and Act as Regulatory Cells Inhibiting Autologous CD4+ T Cell Proliferation. J Immunol. 2015 Aug 1;195(3):965-72. doi: 10.4049/jimmunol.1500591. Epub 2015 Jun 19.
- Ietto G, Mortara L, Dalla Gasperina D, Iovino D, Azzi L, Baj A, Ageno W, Genoni AP, Acquati F, Gallazzi M, Spina G, Coco G, Pierin F, Noonan D, Vigezzi A, Monti E, Iori V, Masci F, Franchi C, Di Saverio S, Carcano G. Immune-Mediated Mechanisms in Patients Testing Positive for SARS-CoV-2: Protocol for a Multianalysis Study. JMIR Res Protoc. 2022 Jan 25;11(1):e29892. doi: 10.2196/29892.
Studierekorddatoer
Studer hoveddatoer
Studiestart (Faktiske)
Primær fullføring (Forventet)
Studiet fullført (Forventet)
Datoer for studieregistrering
Først innsendt
Først innsendt som oppfylte QC-kriteriene
Først lagt ut (Faktiske)
Oppdateringer av studieposter
Sist oppdatering lagt ut (Faktiske)
Siste oppdatering sendt inn som oppfylte QC-kriteriene
Sist bekreftet
Mer informasjon
Begreper knyttet til denne studien
Ytterligere relevante MeSH-vilkår
Andre studie-ID-numre
- 67/2020
Plan for individuelle deltakerdata (IPD)
Planlegger du å dele individuelle deltakerdata (IPD)?
Legemiddel- og utstyrsinformasjon, studiedokumenter
Studerer et amerikansk FDA-regulert medikamentprodukt
Studerer et amerikansk FDA-regulert enhetsprodukt
Denne informasjonen ble hentet direkte fra nettstedet clinicaltrials.gov uten noen endringer. Hvis du har noen forespørsler om å endre, fjerne eller oppdatere studiedetaljene dine, vennligst kontakt register@clinicaltrials.gov. Så snart en endring er implementert på clinicaltrials.gov, vil denne også bli oppdatert automatisk på nettstedet vårt. .