Atividade de monócitos e células NK em pacientes com Covid-19
Estudo de mecanismos imunomediados em pacientes testados positivos para SARS-CoV-2: análise fenotípica e funcional de monócitos e células NK no sangue de indivíduos afetados pelo Covid 19
O SARS-CoV-2 pertence à família beta-coronavírus e sua via de transmissão e sintomas seguem os de todos os coronavírus adquiridos na comunidade. A principal diferença do novo Coronavírus é a maior taxa de mortalidade, que fica em torno de 3%.
A taxa de mortalidade é superior a 1% apenas para pacientes com mais de 50 anos, enquanto até os 40 anos é inferior a 0,4%. Nenhuma morte foi declarada entre crianças menores de 10 anos até o momento. A taxa de mortalidade é quase o dobro para homens do que para mulheres. Essa distribuição da taxa de mortalidade de acordo com a idade dos pacientes infectados poderia ser apenas parcialmente atribuída a outras comorbidades além da idade avançada. De fato, pacientes sem condições pré-existentes têm, no entanto, uma taxa de letalidade de 0,9%.
A taxa quase nula de doença grave em crianças e geralmente em pacientes com menos de 40 anos é bastante inexplicável. Lactentes, crianças e jovens podem ser infectados, mas a infecção é rapidamente autolimitada ou assintomática. Pacientes mais velhos sofrem lesão pulmonar grave como consequência de uma resposta imune tardia.
A possível explicação para esses fenômenos pode ser algo que assegure a capacidade de resposta imediata ao SARS-CoV-2 em pessoas mais jovens, independentemente da novidade do próprio vírus.
Parece que os mais jovens já estão sensibilizados aos antígenos do vírus sem contato prévio.
Essa imunidade não é realmente específica, mas "parcialmente específica" para muitos antígenos do vírus, porém capaz de limitar a infecção no organismo. Algo estimulou o sistema imunológico e espalhou a imunidade contra mais e mais antígenos presentes. As crianças são a faixa etária mais exposta a todos os vírus circulantes na comunidade.
Esta imunidade não é persistente, mas desaparece progressivamente. Protege desde os dois anos de idade, quando ocorre a estimulação hipotética, até a quinta década por causa de sua diminuição lenta.
A única estimulação externa que as pessoas saudáveis recebem são as vacinas. Todas as vacinas e especialmente tetânica, toxóides diftéricos e bactérias inativadas como coqueluche podem estimular o sistema imunológico. Eles desenvolvem a imunidade específica, mas geram também uma imunidade emergente contra antígenos em trânsito, como coronavírus e outros vírus de circulação comunitária.
A imunidade desenvolvida dá alguma proteção contra infecções virais múltiplas por anos até que o natural desapareça.
Após a quinta década, essa imunidade é mais lenta para ser recuperada e reativada. Além disso, receptores de transplantes e pacientes infectados pelo HIV, que têm um sistema imunológico inibido, inesperadamente, não parecem sofrer as piores complicações da infecção por SARS-CoV-2. Um desequilíbrio do sistema imunológico pode desempenhar um papel fundamental durante a reação ao vírus, limitando as consequências destrutivas da inflamação excessiva.
De acordo com a hipótese médica em que se baseia o protocolo, os jovens poderiam se beneficiar de uma adaptação funcional das células imunes inatas induzida por reprogramação epigenética e, principalmente, de uma imunidade "parcialmente específica" pré-existente aos vírus comunitários causados por "espectadores efeito" de vacinações anteriores. Neste estudo, exploraremos as principais diferenças existentes entre os pacientes infectados pelo SARS-CoV-2 que vivenciam a doença em diferentes graus de gravidade. Supõe-se reconhecer diferentes populações de pacientes, cada uma com um padrão imunológico específico. Pode diferir em termos de citocinas, nível sérico de fatores solúveis e atividade de células imunes tanto do compartimento inato quanto do adquirido. A comprovação do papel desses fenômenos imunológicos na patogênese da Covid-19 são bases para a implementação de tratamentos terapêuticos imunomoduladores. Além disso, a definição de um perfil de risco imunológico poderia adequar as terapias estabelecidas para cada tipo de paciente.
Visão geral do estudo
Status
Descrição detalhada
De acordo com a hipótese médica em que se baseia o protocolo, os jovens poderiam se beneficiar de uma adaptação funcional das células imunes inatas induzida por reprogramação epigenética e, principalmente, de uma imunidade "parcialmente específica" pré-existente aos vírus comunitários causados por "espectadores efeito" de vacinações anteriores. Neste estudo, exploraremos as principais diferenças existentes entre os pacientes infectados pelo SARS-CoV-2 que vivenciam a doença em diferentes graus de gravidade. Supõe-se reconhecer diferentes populações de pacientes, cada uma com um padrão imunológico específico. Pode diferir em termos de citocinas, nível sérico de fatores solúveis e atividade de células imunes tanto do compartimento inato quanto do adquirido.
Os dados serão coletados usando 3 abordagens:
- Uma análise experimental, para grupos de pacientes, para estudar a resposta imune inata e identificar os perfis genéticos.
- Uma análise epidemiológica, para identificar o histórico vacinal dos pacientes;
- Uma análise clínica, para detectar o perfil imunológico;
Para a análise específica, para estudar a resposta imune inata e identificar os perfis genéticos, os cientistas vão analisar, a partir do sangue periférico, células NK, monócitos, células T CD4 e CD8 de ambos os grupos: pacientes saudáveis (testados negativos para SARS-CoV -2) e doentes dos subgrupos (AS 19, PAU19, POL19, ARD19).
Amostras de sangue (10-15 mL) de diferentes grupos de pacientes serão coletadas em tubos de EDTA, centrifugadas a 360 g por 10 minutos para obtenção de plasma que será armazenado a -80°C para posterior análise de citocinas e quimiocinas de interesse por ELISA (IL-1b, IL-6, TNF, IFN-a, IL-10, IL-12, CCL2 e CXCL10) no final da inscrição.
Os pellets de células serão trazidos de volta ao volume inicial com PBS e diluídos 1:1 (v/v), e então submetidos a uma estratificação de gradiente de densidade com Ficoll Histopaque-1077, a 500 g por 30 minutos. As Células Mononucleares do Sangue Periférico (PBMCs) derivadas do anel branco serão coletadas, lavadas duas vezes em PBS, e então utilizadas para experimentos subseqüentes usando um ensaio de citômetro de fluxo (REFF). O cultivo in vitro usando PBMCs pode variar de ex vivo 1 dia a alguns dias, e as células serão mantidas em meio RPMI 1640, suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS), 2 mM l-glutamina, 100 U/mL penicilina e 100 μg/mL de estreptomicina (P/S), a 37°C, 5% CO2.
Para realizar a análise do fenótipo do classificador celular ativado por fluorescência ex vivo (FACS), 2,5x105 de PBMCs totais frescos por tubo FACS serão corados por 30 minutos a 4°C com anticorpos monoclonais (mAbs) como se segue: CD3-PerCP, CD56-APC , CD16-FITC, NKG2A-PE, NKG2C-PE, NKGD2-PE, DNAM-1-PE, CD25-PE, CD69-PE. Após a configuração Forward/Side Scatter, as células NK serão identificadas em dois subconjuntos de células, ou seja, como células CD3- e CD56dim CD16+ (células NK CD56dim, o subconjunto principal, cerca de 90%) e células CD3- e CD56bright CD16-/low ( Células NK CD56bright, o subconjunto menor, cerca de 10%). A expressão de outros marcadores será avaliada em ambos os subconjuntos de células fechadas.
Para avaliação ex vivo FACS da análise do fenótipo de monócitos, 2,5x105 de PBMCs totais frescos por tubo FACS serão corados por 30 minutos a 4°C com mAbs da seguinte forma: CD45-APC, CD14-FITC e CD16-V450, PE-CD209, PE-CD80. Após a configuração Forward/Side Scatter, os monócitos serão identificados em três subconjuntos, ou seja, como células CD14+ e CD16- (o subconjunto principal, cerca de 90%), CD14+ CD16+ (o subconjunto secundário, cerca de 10%) e CD14-/baixo CD16+ (o outro subconjunto menor).
Também avaliaremos o fenótipo para células T CD4 e CD8 e a relação CD4/CD8 T usando 2x105 de PBMCs totais frescas, conforme descrito anteriormente, com os seguintes mAbs: CD3-PerCP, CD4-APC, CD8-V450, bem como T regulador (Treg ), como CD3-PerCP, CD4-APC, CD25-PE.
As PBMCs também serão estimuladas in vitro por 4 h com diferentes tipos de estímulos, como LPS (reconhecido pelo TLR4), poli(I:C) (reconhecido pelo TLR3), poli(I:C) mais IL-2 mais IL-12 e acetato de miristato de forbol (PMA) mais ionomicina na presença de monensina e brefeldina. Este procedimento permitirá estudar a produção específica de citocinas/quimiocinas a partir de células NK e monócitos usando um ensaio intracelular FACS, conforme descrito anteriormente (REFF). Para células NK, mediremos IFN-a-PE, TNF-PE, CCL2-PE, CXCL10-PE e CD107a-PE (marcador de degranulação). Para monócitos investigaremos: IL-6-PE, TNFa-PE, IL-12-PE, CXCL10-PE (marcadores pró-inflamatórios do tipo M1) e TGFb-PE, IL-10-PE, CCL18-PE (M2 -marcadores anti-inflamatórios do tipo) Sempre que a quantidade de PBMCs for suficiente, outros testes funcionais in vitro em células NK e monócitos serão realizados. Em particular, as PBMCs serão estudadas para degranulação/função citotóxica de células NK em 4 h em relação à linha celular eritroleucêmica K562, avaliando a superfície CD107a-PE usando um ensaio citofluorimétrico de fluxo (REFF).
Sempre que a quantidade de PBMCs for suficiente, os monócitos serão purificados usando microesferas anti-CD14 com separador magnético e células NK com kit RosetteSep para obter > 90% das populações de células purificadas.
Monócitos purificados e NK purificados podem ser mantidos separados ou juntos em cultura usando meio RPMI 1640 com 10% FBS e suplementado com M-CSF e IL-2, respectivamente, estimulados com estímulos diferentes (ver acima) e depois verificados quanto a citocinas intracelulares /quimiocinas de interesse (ver acima). Ao mesmo tempo, os sobrenadantes (meio condicionado, CM) podem ser colhidos no final da cultura de incubação in vitro e avaliados quanto a citocinas/quimiocinas usando ELISA (IL-1b, IL-6, TNFa, IFNa, IL-10, IL- 12, CXCL10).
A cultura in vitro de 4-5 dias de monócitos será ainda estimulada 24 h com LPS mais IFNg (estímulo M1) ou (IL-4) (estímulo M2) para investigar a polarização de macrófagos estudando marcadores M1 de superfície (TNF, CXCL10) ou marcadores M2 (IL-10, CCL18) para verificar a prevalência de polarização de macrófagos em diferentes grupos de pacientes com Covid-19.
A análise epidemiológica será realizada integrando tanto a história vacinal quanto os dados coletados diariamente após a internação. Os arquivos ATS Insubria fornecerão dados ausentes.
Considerando o perfil imunológico, os pacientes com Covid-19 serão testados para exames de rotina e os seguintes:
- imunofenotipagem de linfócitos;
- determinação da atividade das frações C3 e C4 do complemento;
- nível sérico de imunoglobulina (IgG, IgM, IgA, IgE);
- eletroforese de proteínas séricas;
- nível sérico da Enzima Conversora de Angiotensina (ECA);
- sorologia para CMV (Citomegalovírus);
- nível sérico de IL-6.
Tipo de estudo
Inscrição (Antecipado)
Contactos e Locais
Locais de estudo
-
-
-
Varese, Itália, 21100
- Recrutamento
- ATS Insubria
-
Contato:
- Giuseppe Ietto, M.D.
- Número de telefone: +393398758024
- E-mail: giuseppe.ietto@gmail.com
-
Investigador principal:
- Giuseppe Ietto, MD
-
Investigador principal:
- Lorenzo Mortara, Professor
-
Subinvestigador:
- Domenico Iovino, MD
-
Subinvestigador:
- Daniela Dalla Gasperina, Professor
-
Investigador principal:
- Giulio Carcano, Professor
-
Subinvestigador:
- Andreina Baj, MD
-
Subinvestigador:
- Walter Ageno, Professor
-
Subinvestigador:
- Francesco Acquati, Professor
-
Subinvestigador:
- Angelo Genoni, Dr
-
Subinvestigador:
- Denisa Baci, PhD
-
Subinvestigador:
- Matteo Gallazzi, PhD
-
Subinvestigador:
- Annarosaria De Vito, PhD
-
Subinvestigador:
- Elisa Monti, MD
-
Subinvestigador:
- Andrea Vigezzi, MD
-
Subinvestigador:
- Caterina Franchi, MD
-
Subinvestigador:
- Valentina Iori, MD
-
Subinvestigador:
- Federica Masci, MD
-
-
Critérios de participação
Critérios de elegibilidade
Idades elegíveis para estudo
Aceita Voluntários Saudáveis
Gêneros Elegíveis para o Estudo
Método de amostragem
População do estudo
Descrição
Critério de inclusão:
- Idade: ≥ 18
- Infecção documentada por SARS-CoV-2
Critério de exclusão:
- Recusa em assinar o acordo (consentimento informado);
- Impossibilidade de assinar o acordo;
- Infecção por HIV, HCV, HBV (positivo para HBsAg).
Plano de estudo
Como o estudo é projetado?
Detalhes do projeto
- Modelos de observação: Caso-somente
- Perspectivas de Tempo: Prospectivo
Coortes e Intervenções
Grupo / Coorte |
Intervenção / Tratamento |
|---|---|
|
Testado positivo para SARS-CoV-2
Os pacientes com teste positivo para SARS-CoV-2 serão recrutados no pronto-socorro do Hospital Universitário "Ospedale Di Circolo - ASST Settelaghi" em Varese.
|
Análise fenotípica e funcional de monócitos e células NK
|
O que o estudo está medindo?
Medidas de resultados primários
Medida de resultado |
Descrição da medida |
Prazo |
|---|---|---|
|
Atividade das células imunes
Prazo: 6 meses
|
A hipótese dos cientistas é que os monócitos, células NK, CD4 E CD8 T, em pacientes com infecção grave por SARS-CoV-2, apresentam um comprometimento em sua função: as células revelam uma hiperatividade avassaladora que provoca uma resposta inflamatória patológica com uma produção massiva de citocina pró-inflamatória, edema e fibrose pulmonar.
|
6 meses
|
Medidas de resultados secundários
Medida de resultado |
Descrição da medida |
Prazo |
|---|---|---|
|
Fatores protetores e novas estratégias terapêuticas
Prazo: 6 meses
|
Os objetivos secundários são correlacionar dados clínicos e histórico de vacinação com padrão imunológico laboratorial para identificar fatores de proteção para Covid 19 e abrir caminhos para novas estratégias terapêuticas.
|
6 meses
|
Colaboradores e Investigadores
Patrocinador
Investigadores
- Cadeira de estudo: Giulio Carcano, Professor, Università degli Studi dell'Insubria
- Investigador principal: Giuseppe Ietto, M.D., Università degli Studi dell'Insubria
- Investigador principal: Lorenzo Mortara, Professor, Università degli Studi dell'Insubria
Publicações e links úteis
Publicações Gerais
- Netea MG, Dominguez-Andres J, Barreiro LB, Chavakis T, Divangahi M, Fuchs E, Joosten LAB, van der Meer JWM, Mhlanga MM, Mulder WJM, Riksen NP, Schlitzer A, Schultze JL, Stabell Benn C, Sun JC, Xavier RJ, Latz E. Defining trained immunity and its role in health and disease. Nat Rev Immunol. 2020 Jun;20(6):375-388. doi: 10.1038/s41577-020-0285-6. Epub 2020 Mar 4.
- Benn CS, Netea MG, Selin LK, Aaby P. A small jab - a big effect: nonspecific immunomodulation by vaccines. Trends Immunol. 2013 Sep;34(9):431-9. doi: 10.1016/j.it.2013.04.004. Epub 2013 May 14.
- Ietto G. SARS - CoV-2: Reasons of epidemiology of severe ill disease cases and therapeutic approach using trivalent vaccine (tetanus, diphtheria and Bordetella pertussis). Med Hypotheses. 2020 Aug;141:109779. doi: 10.1016/j.mehy.2020.109779. Epub 2020 Apr 22.
- Murray PJ, Allen JE, Biswas SK, Fisher EA, Gilroy DW, Goerdt S, Gordon S, Hamilton JA, Ivashkiv LB, Lawrence T, Locati M, Mantovani A, Martinez FO, Mege JL, Mosser DM, Natoli G, Saeij JP, Schultze JL, Shirey KA, Sica A, Suttles J, Udalova I, van Ginderachter JA, Vogel SN, Wynn TA. Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 2014 Jul 17;41(1):14-20. doi: 10.1016/j.immuni.2014.06.008.
- Noonan DM, De Lerma Barbaro A, Vannini N, Mortara L, Albini A. Inflammation, inflammatory cells and angiogenesis: decisions and indecisions. Cancer Metastasis Rev. 2008 Mar;27(1):31-40. doi: 10.1007/s10555-007-9108-5.
- Parisi L, Gini E, Baci D, Tremolati M, Fanuli M, Bassani B, Farronato G, Bruno A, Mortara L. Macrophage Polarization in Chronic Inflammatory Diseases: Killers or Builders? J Immunol Res. 2018 Jan 14;2018:8917804. doi: 10.1155/2018/8917804. eCollection 2018.
- Bruno A, Focaccetti C, Pagani A, Imperatori AS, Spagnoletti M, Rotolo N, Cantelmo AR, Franzi F, Capella C, Ferlazzo G, Mortara L, Albini A, Noonan DM. The proangiogenic phenotype of natural killer cells in patients with non-small cell lung cancer. Neoplasia. 2013 Feb;15(2):133-42. doi: 10.1593/neo.121758.
- Bruno A, Bassani B, D'Urso DG, Pitaku I, Cassinotti E, Pelosi G, Boni L, Dominioni L, Noonan DM, Mortara L, Albini A. Angiogenin and the MMP9-TIMP2 axis are up-regulated in proangiogenic, decidual NK-like cells from patients with colorectal cancer. FASEB J. 2018 Oct;32(10):5365-5377. doi: 10.1096/fj.201701103R. Epub 2018 May 15.
- Bassani B, Baci D, Gallazzi M, Poggi A, Bruno A, Mortara L. Natural Killer Cells as Key Players of Tumor Progression and Angiogenesis: Old and Novel Tools to Divert Their Pro-Tumor Activities into Potent Anti-Tumor Effects. Cancers (Basel). 2019 Apr 1;11(4):461. doi: 10.3390/cancers11040461.
- Morandi F, Horenstein AL, Chillemi A, Quarona V, Chiesa S, Imperatori A, Zanellato S, Mortara L, Gattorno M, Pistoia V, Malavasi F. CD56brightCD16- NK Cells Produce Adenosine through a CD38-Mediated Pathway and Act as Regulatory Cells Inhibiting Autologous CD4+ T Cell Proliferation. J Immunol. 2015 Aug 1;195(3):965-72. doi: 10.4049/jimmunol.1500591. Epub 2015 Jun 19.
- Ietto G, Mortara L, Dalla Gasperina D, Iovino D, Azzi L, Baj A, Ageno W, Genoni AP, Acquati F, Gallazzi M, Spina G, Coco G, Pierin F, Noonan D, Vigezzi A, Monti E, Iori V, Masci F, Franchi C, Di Saverio S, Carcano G. Immune-Mediated Mechanisms in Patients Testing Positive for SARS-CoV-2: Protocol for a Multianalysis Study. JMIR Res Protoc. 2022 Jan 25;11(1):e29892. doi: 10.2196/29892.
Datas de registro do estudo
Datas Principais do Estudo
Início do estudo (Real)
Conclusão Primária (Antecipado)
Conclusão do estudo (Antecipado)
Datas de inscrição no estudo
Enviado pela primeira vez
Enviado pela primeira vez que atendeu aos critérios de CQ
Primeira postagem (Real)
Atualizações de registro de estudo
Última Atualização Postada (Real)
Última atualização enviada que atendeu aos critérios de controle de qualidade
Última verificação
Mais Informações
Termos relacionados a este estudo
Termos MeSH relevantes adicionais
Outros números de identificação do estudo
- 67/2020
Plano para dados de participantes individuais (IPD)
Planeja compartilhar dados de participantes individuais (IPD)?
Informações sobre medicamentos e dispositivos, documentos de estudo
Estuda um medicamento regulamentado pela FDA dos EUA
Estuda um produto de dispositivo regulamentado pela FDA dos EUA
Essas informações foram obtidas diretamente do site clinicaltrials.gov sem nenhuma alteração. Se você tiver alguma solicitação para alterar, remover ou atualizar os detalhes do seu estudo, entre em contato com register@clinicaltrials.gov. Assim que uma alteração for implementada em clinicaltrials.gov, ela também será atualizada automaticamente em nosso site .