Monocyter och NK-cellsaktivitet hos Covid-19-patienter
Studie av immunmedierade mekanismer hos patienter som testats positivt för SARS-CoV-2: Fenotypisk och funktionell analys av monocyter och NK-celler i blodet hos patienter som drabbats av Covid 19
SARS-CoV-2 tillhör beta-coronavirusfamiljen och dess överföringsväg och symtom följer de för alla samhällsförvärvade coronavirus. Den största skillnaden mellan det nya Coronaviruset är den högre dödligheten, det vill säga cirka 3%.
Dödsfrekvensen är över 1 % endast för patienter över 50 år, medan fram till 40 år är under 0,4 %. Inga dödsfall har rapporterats bland barn under 10 år hittills. Dödligheten är nästan dubbelt så stor för män snarare än kvinnor. Denna fördelning av dödligheten efter ålder hos infekterade patienter kunde endast delvis tillskrivas andra samsjukligheter förutom hög ålder. Faktum är att patienter utan tidigare tillstånd har dock en dödlighet på 0,9 %.
Den nästan nolla graden av allvarlig sjukdom hos barn och i allmänhet hos patienter yngre än 40 år är ganska oförklarlig. Spädbarn, barn och ungdomar kan bli smittade men infektionen är snabbt självbegränsande eller utan symtom. Äldre patienter får allvarliga lungskador till följd av ett sent immunsvar.
Möjlig förklaring av dessa fenomen kan vara något som säkerställer förmågan att snabbt svara på SARS-CoV-2 hos yngre människor oberoende av själva virusets nyhet.
Det verkar vara så att yngre människor redan är sensibiliserade för virusets antigener utan tidigare kontakt.
Denna immunitet är inte riktigt specifik, utan "delvis specifik" för många antigener av viruset, men kan begränsa infektionen i organismen. Något stimulerade immunförsvaret och det spred immuniteten mot fler och fler antigener närvarande. Barn är den åldersgrupp som mest exponeras för alla virus som cirkulerar i samhället.
Denna immunitet är inte ihållande utan försvinner gradvis. Den skyddar från två års ålder, när den hypotetiska stimuleringen inträffar, till det femte decenniet på grund av dess långsamma minskning.
Den enda yttre stimulans som friska människor får är vacciner. Alla vaccinationer och speciellt tetaniker, difteritoxoider och inaktiverade bakterier som kikhosta kan stimulera immunförsvaret. De utvecklar den specifika immuniteten men genererar också en spirande immunitet mot antigener i transit, som coronavirus och andra virus som cirkulerar i samhället.
Den utvecklade immuniteten ger ett visst skydd mot multipel virusinfektion i flera år tills den naturliga bleknar ut.
Efter det femte decenniet är den immuniteten långsammare att återkallas och återaktiveras. Dessutom verkar transplantationsmottagare och HIV-infekterade patienter, som har ett hämmat immunsystem, oväntat inte drabbas av de värsta komplikationerna av SARS-CoV-2-infektion. En obalans i immunsystemet kan spela en avgörande roll under reaktionen på viruset, vilket begränsar destruktiva konsekvenser av överdriven inflammation.
Enligt den medicinska hypotesen som protokollet bygger på kan unga människor dra nytta av en funktionell anpassning av medfödda immunceller inducerad genom epigenetisk omprogrammering och, särskilt, en redan existerande "delvis specifik" immunitet mot gemenskapsvirus orsakade av "åskådare" effekt" av föregående vaccinationer. I denna studie kommer vi att undersöka de huvudsakliga skillnaderna som finns mellan patienter infekterade av SARS-CoV-2 som upplever sjukdomen med olika svårighetsgrad. Vi antar att vi känner igen olika populationer av patienter, var och en med ett specifikt immunologiskt mönster. Det kan skilja sig åt i termer av cytokiner, lösliga faktorers serumnivå och immuncellsaktivitet både i det medfödda utrymmet och det förvärvade. Beviset på en roll av dessa immunologiska fenomen i patogenesen av Covid-19 är baser för implementering av terapeutiska immunmodulerande behandlingar. Dessutom skulle definitionen av en immunologisk riskprofil kunna skräddarsy etablerade terapier för varje typ av patient.
Studieöversikt
Status
Detaljerad beskrivning
Enligt den medicinska hypotesen som protokollet bygger på kan unga människor dra nytta av en funktionell anpassning av medfödda immunceller inducerad genom epigenetisk omprogrammering och, särskilt, en redan existerande "delvis specifik" immunitet mot gemenskapsvirus orsakade av "åskådare" effekt" av föregående vaccinationer. I denna studie kommer vi att undersöka de huvudsakliga skillnaderna som finns mellan patienter infekterade av SARS-CoV-2 som upplever sjukdomen med olika svårighetsgrad. Vi antar att vi känner igen olika populationer av patienter, var och en med ett specifikt immunologiskt mönster. Det kan skilja sig åt i termer av cytokiner, lösliga faktorers serumnivå och immuncellsaktivitet både i det medfödda utrymmet och det förvärvade.
Data kommer att samlas in med hjälp av tre metoder:
- En experimentell analys, för kluster av patienter, för att studera det medfödda immunsvaret och för att identifiera de genetiska profilerna.
- En epidemiologisk analys, för att identifiera patienternas vaccinationshistorik;
- En klinisk analys för att detektera den immunologiska profilen;
För den specifika analysen, för att studera det medfödda immunsvaret och för att identifiera de genetiska profilerna, kommer forskare att analysera, från det perifera blodet, NK-celler, monocyter, CD4 och CD8 T-celler från båda grupperna: friska patienter (testade negativt för SARS-CoV -2) och sjuka patienter i undergrupperna (AS 19, PAU19, POL19, ARD19).
Från olika grupper av patienter kommer blodprover (10-15 ml) att tas i EDTA-rör, centrifugeras vid 360 g i 10 minuter för att erhålla plasma som kommer att förvaras vid -80°C för efterföljande analys av cytokiner och kemokiner av intresse. genom ELISA (IL-lb, IL-6, TNF, IFN-a, IL-10, IL-12, CCL2 och CXCL10) vid slutet av registreringen.
Cellpelletsen kommer att föras tillbaka till den ursprungliga volymen med PBS och spädas 1:1 (v/v), och sedan utsättas för en densitetsgradientstratifiering med Ficoll Histopaque-1077, vid 500 g i 30 minuter. Perifera blodmononukleära celler (PBMC) som härrör från den vita ringen kommer att samlas in, tvättas två gånger i PBS och sedan användas för efterföljande experiment med en flödescytometeranalys (REFF). In vitro-odlingen med PBMC kan variera från ex vivo 1 dag till några dagar, och cellerna kommer att bibehållas i RPMI 1640-medium, kompletterat med 10 % fetalt bovint serum (FBS), 2 mM l-glutamin, 100 U/ml penicillin och 100 μg/mL streptomycin (P/S), vid 37°C, 5 % CO2.
För att utföra ex vivo fluorescensaktiverad cellsorterare (FACS) fenotypanalys, kommer 2,5x105 färska totala PBMC per FACS-rör att färgas i 30 minuter vid 4°C med monoklonala antikroppar (mAbs) enligt följande: CD3-PerCP, CD56-APC , CD16-FITC, NKG2A-PE, NKG2C-PE, NKGD2-PE, DNAM-1-PE, CD25-PE, CD69-PE. Efter inställningen Forward/Side Scatter kommer NK-celler att identifieras i två cellunderuppsättningar, d.v.s. som CD3- och CD56dim CD16+-celler (CD56dim NK-celler, huvudundergruppen, cirka 90%) och CD3- och CD56bright CD16-/lågceller ( CD56bright NK-celler, den mindre delmängden, cirka 10 %). Andra marköruttryck kommer att utvärderas på båda undergrupperna av gated celler.
För ex vivo FACS-utvärdering av monocyter-fenotypanalys, kommer 2,5x105 färska totala PBMC per FACS-rör att färgas i 30 minuter vid 4°C med mAbs enligt följande: CD45-APC, CD14-FITC och CD16-V450, PE-CD209, PE-CD80. Efter inställningen Forward/Side Scatter kommer monocyter att identifieras i tre delmängder, d.v.s. som CD14+ och CD16-celler (huvuddelmängden, cirka 90 %), CD14+ CD16+ (den mindre delmängden, cirka 10 %) och CD14-/låg CD16+ (den andra mindre delmängden).
Vi kommer också att utvärdera fenotyp för CD4 och CD8 T-celler och CD4/CD8 T-förhållande med användning av 2x105 färska totala PBMC, som tidigare beskrivits, med följande mAbs: CD3-PerCP, CD4-APC, CD8-V450 såväl som T-regulatoriska (Treg) ) celler, som CD3-PerCP, CD4-APC, CD25-PE.
PBMC:er kommer också att stimuleras in vitro under 4 timmar med olika typer av stimuli, såsom LPS (känd av TLR4), poly(I:C) (igenkänns av TLR3), poly (I:C) plus IL-2 plus IL-12 och forbolmyristatacetat (PMA) plus jonomycin i närvaro av monensin och brefeldin. Denna procedur gör det möjligt att studera specifik cytokin/kemokinproduktion från NK-celler och monocyter genom att använda en intracellulär FACS-analys, som beskrivits tidigare (REFF). För NK-celler kommer vi att mäta IFN-a-PE, TNF-PE, CCL2-PE, CXCL10-PE och CD107a-PE (degranuleringsmarkör). För monocyter kommer vi att undersöka: IL-6-PE, TNFa-PE, IL-12-PE, CXCL10-PE (M1-typ pro-inflammatoriska markörer) och TGFb-PE, IL-10-PE, CCL18-PE (M2) antiinflammatoriska markörer av typen) Närhelst mängden PBMC är tillräcklig kommer andra funktionella in vitro-tester på NK-celler och monocyter att göras. I synnerhet kommer PBMC att studeras för 4 timmars NK-cellsdegranulering/cytotoxisk funktion mot erytroleukemisk K562-cellinje som bedömer ytan CD107a-PE med hjälp av en flödescytofluorimetrisk analys (REFF).
Närhelst mängden PBMC är tillräcklig, kommer monocyter att renas med anti-CD14 mikropärlor med magnetisk separator och NK-celler med RosetteSep-kit för att erhålla >90% renade cellpopulationer.
Renade monocyter och renat NK kunde hållas åtskilda eller tillsammans i odling med användning av RPMI 1640-medium med 10 % FBS, och kompletteras med M-CSF respektive IL-2, stimulerade med olika stimuli (se ovan), och sedan kontrolleras för intracellulära cytokiner /kemokiner av intresse (se ovan). Samtidigt kunde supernatanterna (konditionerat medium, CM) skördas i slutet av in vitro-inkubationskulturen och bedömas med avseende på cytokiner/kemokiner med användning av ELISA (IL-1b, IL-6, TNFa, IFNa, IL-10, IL- 12, CXCL10).
De 4-5 dagar långa in vitro-odlingarna av monocyter kommer att stimuleras ytterligare 24 timmar med LPS plus IFNg (M1-stimulus) eller (IL-4) (M2-stimulus) för att undersöka makrofagpolarisation som studerar yt-M1-markörer (TNF, CXCL10) eller M2-markörer (IL-10, CCL18) för att kontrollera förekomsten av makrofagpolarisering i olika grupper av Covid-19-patienter.
Den epidemiologiska analysen kommer att genomföras genom att integrera både vaccinationshistorik och data som samlas in dagligen efter sjukhusvistelse. ATS Insubria-arkiv kommer att tillhandahålla saknad data.
Med tanke på den immunologiska profilen kommer patienter med Covid-19 att testas för rutinundersökningar och följande:
- lymfocytimmunfenotypning;
- bestämning av C3- och C4-komplementfraktionernas aktivitet;
- immunoglobulin (IgG, IgM, IgA, IgE) serumnivå;
- serumproteinelektrofores;
- Angiotensin Converting Enzyme (ACE) serumnivå;
- CMV (Citomegalovirus) serologitest;
- IL-6 serumnivå.
Studietyp
Inskrivning (Förväntat)
Kontakter och platser
Studieorter
-
-
-
Varese, Italien, 21100
- Rekrytering
- ATS Insubria
-
Kontakt:
- Giuseppe Ietto, M.D.
- Telefonnummer: +393398758024
- E-post: giuseppe.ietto@gmail.com
-
Huvudutredare:
- Giuseppe Ietto, MD
-
Huvudutredare:
- Lorenzo Mortara, Professor
-
Underutredare:
- Domenico Iovino, MD
-
Underutredare:
- Daniela Dalla Gasperina, Professor
-
Huvudutredare:
- Giulio Carcano, Professor
-
Underutredare:
- Andreina Baj, MD
-
Underutredare:
- Walter Ageno, Professor
-
Underutredare:
- Francesco Acquati, Professor
-
Underutredare:
- Angelo Genoni, Dr
-
Underutredare:
- Denisa Baci, PhD
-
Underutredare:
- Matteo Gallazzi, PhD
-
Underutredare:
- Annarosaria De Vito, PhD
-
Underutredare:
- Elisa Monti, MD
-
Underutredare:
- Andrea Vigezzi, MD
-
Underutredare:
- Caterina Franchi, MD
-
Underutredare:
- Valentina Iori, MD
-
Underutredare:
- Federica Masci, MD
-
-
Deltagandekriterier
Urvalskriterier
Åldrar som är berättigade till studier
Tar emot friska volontärer
Kön som är behöriga för studier
Testmetod
Studera befolkning
Beskrivning
Inklusionskriterier:
- Ålder: ≥ 18 år
- SARS-CoV-2 dokumenterad infektion
Exklusions kriterier:
- Vägran att underteckna avtalet (informerat samtycke);
- Oförmåga att underteckna avtalet;
- HIV, HCV, HBV (positiv till HBsAg) infektion.
Studieplan
Hur är studien utformad?
Designdetaljer
- Observationsmodeller: Endast fall
- Tidsperspektiv: Blivande
Kohorter och interventioner
Grupp / Kohort |
Intervention / Behandling |
|---|---|
|
Testade positivt för SARS-CoV-2
Patienter, testade positiva för SARS-CoV-2, kommer att rekryteras till E.R. av "Ospedale Di Circolo - ASST Settelaghi" Teaching Hospital i Varese.
|
Fenotypisk och funktionell analys av monocyter och NK-celler
|
Vad mäter studien?
Primära resultatmått
Resultatmått |
Åtgärdsbeskrivning |
Tidsram |
|---|---|---|
|
Immuncellers aktivitet
Tidsram: 6 månader
|
Forskarnas hypotes är att monocyter, NK, CD4 OCH CD8 T-celler, hos patienter med allvarlig infektion med SARS-CoV-2, visar en funktionsnedsättning: celler avslöjar en överväldigande hyperaktivitet som framkallar ett patologiskt inflammatoriskt svar med en massiv produktion av proinflammatoriskt cytokin, ödem och lungfibros.
|
6 månader
|
Sekundära resultatmått
Resultatmått |
Åtgärdsbeskrivning |
Tidsram |
|---|---|---|
|
Skyddsfaktorer och nya terapeutiska strategier
Tidsram: 6 månader
|
De sekundära målen är att korrelera kliniska data och vaccinationshistorik med laboratorieimmunmönster för att identifiera skyddande faktorer för Covid 19 och öppna vägar för nya terapeutiska strategier.
|
6 månader
|
Samarbetspartners och utredare
Utredare
- Studiestol: Giulio Carcano, Professor, Università degli Studi dell'Insubria
- Huvudutredare: Giuseppe Ietto, M.D., Università degli Studi dell'Insubria
- Huvudutredare: Lorenzo Mortara, Professor, Università degli Studi dell'Insubria
Publikationer och användbara länkar
Allmänna publikationer
- Netea MG, Dominguez-Andres J, Barreiro LB, Chavakis T, Divangahi M, Fuchs E, Joosten LAB, van der Meer JWM, Mhlanga MM, Mulder WJM, Riksen NP, Schlitzer A, Schultze JL, Stabell Benn C, Sun JC, Xavier RJ, Latz E. Defining trained immunity and its role in health and disease. Nat Rev Immunol. 2020 Jun;20(6):375-388. doi: 10.1038/s41577-020-0285-6. Epub 2020 Mar 4.
- Benn CS, Netea MG, Selin LK, Aaby P. A small jab - a big effect: nonspecific immunomodulation by vaccines. Trends Immunol. 2013 Sep;34(9):431-9. doi: 10.1016/j.it.2013.04.004. Epub 2013 May 14.
- Ietto G. SARS - CoV-2: Reasons of epidemiology of severe ill disease cases and therapeutic approach using trivalent vaccine (tetanus, diphtheria and Bordetella pertussis). Med Hypotheses. 2020 Aug;141:109779. doi: 10.1016/j.mehy.2020.109779. Epub 2020 Apr 22.
- Murray PJ, Allen JE, Biswas SK, Fisher EA, Gilroy DW, Goerdt S, Gordon S, Hamilton JA, Ivashkiv LB, Lawrence T, Locati M, Mantovani A, Martinez FO, Mege JL, Mosser DM, Natoli G, Saeij JP, Schultze JL, Shirey KA, Sica A, Suttles J, Udalova I, van Ginderachter JA, Vogel SN, Wynn TA. Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 2014 Jul 17;41(1):14-20. doi: 10.1016/j.immuni.2014.06.008.
- Noonan DM, De Lerma Barbaro A, Vannini N, Mortara L, Albini A. Inflammation, inflammatory cells and angiogenesis: decisions and indecisions. Cancer Metastasis Rev. 2008 Mar;27(1):31-40. doi: 10.1007/s10555-007-9108-5.
- Parisi L, Gini E, Baci D, Tremolati M, Fanuli M, Bassani B, Farronato G, Bruno A, Mortara L. Macrophage Polarization in Chronic Inflammatory Diseases: Killers or Builders? J Immunol Res. 2018 Jan 14;2018:8917804. doi: 10.1155/2018/8917804. eCollection 2018.
- Bruno A, Focaccetti C, Pagani A, Imperatori AS, Spagnoletti M, Rotolo N, Cantelmo AR, Franzi F, Capella C, Ferlazzo G, Mortara L, Albini A, Noonan DM. The proangiogenic phenotype of natural killer cells in patients with non-small cell lung cancer. Neoplasia. 2013 Feb;15(2):133-42. doi: 10.1593/neo.121758.
- Bruno A, Bassani B, D'Urso DG, Pitaku I, Cassinotti E, Pelosi G, Boni L, Dominioni L, Noonan DM, Mortara L, Albini A. Angiogenin and the MMP9-TIMP2 axis are up-regulated in proangiogenic, decidual NK-like cells from patients with colorectal cancer. FASEB J. 2018 Oct;32(10):5365-5377. doi: 10.1096/fj.201701103R. Epub 2018 May 15.
- Bassani B, Baci D, Gallazzi M, Poggi A, Bruno A, Mortara L. Natural Killer Cells as Key Players of Tumor Progression and Angiogenesis: Old and Novel Tools to Divert Their Pro-Tumor Activities into Potent Anti-Tumor Effects. Cancers (Basel). 2019 Apr 1;11(4):461. doi: 10.3390/cancers11040461.
- Morandi F, Horenstein AL, Chillemi A, Quarona V, Chiesa S, Imperatori A, Zanellato S, Mortara L, Gattorno M, Pistoia V, Malavasi F. CD56brightCD16- NK Cells Produce Adenosine through a CD38-Mediated Pathway and Act as Regulatory Cells Inhibiting Autologous CD4+ T Cell Proliferation. J Immunol. 2015 Aug 1;195(3):965-72. doi: 10.4049/jimmunol.1500591. Epub 2015 Jun 19.
- Ietto G, Mortara L, Dalla Gasperina D, Iovino D, Azzi L, Baj A, Ageno W, Genoni AP, Acquati F, Gallazzi M, Spina G, Coco G, Pierin F, Noonan D, Vigezzi A, Monti E, Iori V, Masci F, Franchi C, Di Saverio S, Carcano G. Immune-Mediated Mechanisms in Patients Testing Positive for SARS-CoV-2: Protocol for a Multianalysis Study. JMIR Res Protoc. 2022 Jan 25;11(1):e29892. doi: 10.2196/29892.
Studieavstämningsdatum
Studera stora datum
Studiestart (Faktisk)
Primärt slutförande (Förväntat)
Avslutad studie (Förväntat)
Studieregistreringsdatum
Först inskickad
Först inskickad som uppfyllde QC-kriterierna
Första postat (Faktisk)
Uppdateringar av studier
Senaste uppdatering publicerad (Faktisk)
Senaste inskickade uppdateringen som uppfyllde QC-kriterierna
Senast verifierad
Mer information
Termer relaterade till denna studie
Ytterligare relevanta MeSH-villkor
Andra studie-ID-nummer
- 67/2020
Plan för individuella deltagardata (IPD)
Planerar du att dela individuella deltagardata (IPD)?
Läkemedels- och apparatinformation, studiedokument
Studerar en amerikansk FDA-reglerad läkemedelsprodukt
Studerar en amerikansk FDA-reglerad produktprodukt
Denna information hämtades direkt från webbplatsen clinicaltrials.gov utan några ändringar. Om du har några önskemål om att ändra, ta bort eller uppdatera dina studieuppgifter, vänligen kontakta register@clinicaltrials.gov. Så snart en ändring har implementerats på clinicaltrials.gov, kommer denna att uppdateras automatiskt även på vår webbplats .