Denne side blev automatisk oversat, og nøjagtigheden af ​​oversættelsen er ikke garanteret. Der henvises til engelsk version for en kildetekst.

Monocytter og NK-cellers aktivitet hos Covid-19-patienter

3. maj 2020 opdateret af: Ietto Giuseppe, Università degli Studi dell'Insubria

Undersøgelse af immunmedierede mekanismer hos patienter testet positive for SARS-CoV-2: Fænotypisk og funktionel analyse af monocytter og NK-celler i blodet hos forsøgspersoner berørt af Covid 19

SARS-CoV-2 tilhører beta-coronavirus-familien og dens smittevej og symptomer følger dem for alle samfundserhvervede coronavirus. Den største forskel på den nye Coronavirus er den højere dødelighed, der er omkring 3%.

Dødsraten er kun over 1 % for patienter over 50 år, mens indtil 40 år er under 0,4 %. Der er ikke erklæret dødsfald blandt børn under 10 år til dato. Dødsraten er næsten dobbelt for mænd i stedet for kvinder. Denne fordeling af dødeligheden efter alder af inficerede patienter kunne kun delvist tilskrives andre komorbiditeter ud over høj alder. Faktisk har patienter uden allerede eksisterende tilstande dog en dødsrate på 0,9 %.

Den næsten nulrate for alvorlig sygdom hos børn og generelt hos patienter under 40 år er ganske uforklarlig. Spædbørn, børn og unge kan blive smittet, men infektionen er hurtigt selvbegrænsende eller uden symptomer. Ældre patienter får alvorlig lungeskade som følge af et immunrespons, der kommer for sent.

Mulig forklaring på disse fænomener kunne være noget, der sikrer evnen til at fremskynde respons på SARS-CoV-2 hos yngre mennesker uafhængigt af nyheden i selve virussen.

Det ser ud til at være, at yngre mennesker allerede er sensibiliserede over for virusets antigener uden tidligere kontakt.

Denne immunitet er ikke rigtig specifik, men "delvis specifik" for mange antigener af virussen, dog i stand til at begrænse infektionen i organismen. Noget stimulerede immunsystemet, og det spredte immunitet mod flere og flere tilstedeværende antigener. Børn er den aldersgruppe, der for det meste er udsat for alle samfundscirkulerende vira.

Denne immunitet er ikke vedvarende, men forsvinder gradvist. Den beskytter fra 2-årsalderen, når den hypotetiske stimulation finder sted, til det femte årti på grund af dets langsomme fald.

Den eneste ydre stimulering, som raske mennesker modtager, er vacciner. Alle vaccinationer og især stivkrampe, difteritoksoider og inaktiverede bakterier som pertussis kunne stimulere immunsystemet. De udvikler den specifikke immunitet, men genererer også en spirende immunitet mod antigener i transit, som coronavirus og andre vira, der cirkulerer i lokalsamfundet.

Den udviklede immunitet giver en vis beskyttelse mod flere virusinfektioner i årevis, indtil den naturlige fade ud.

Efter det femte årti er denne immunitet langsommere til at blive genkaldt og genaktiveret. Derudover ser transplantationsmodtagere og HIV-inficerede patienter, som har et hæmmet immunsystem, uventet ikke ud til at lide af de værste komplikationer af SARS-CoV-2-infektion. En ubalance i immunsystemet kan spille en central rolle under reaktionen på virussen, hvilket begrænser de destruktive konsekvenser af overdreven inflammation.

Ifølge den medicinske hypotese, som protokollen er baseret på, kunne unge mennesker drage fordel af en funktionel tilpasning af medfødte immunceller induceret gennem epigenetisk omprogrammering og især en allerede eksisterende "delvis specifik" immunitet over for samfundsvira forårsaget af "tilskuere". effekt" af forudgående vaccinationer. I denne undersøgelse vil vi udforske de vigtigste forskelle, der eksisterer blandt patienter inficeret med SARS-CoV-2, som oplever sygdommen i forskellig grad af sværhedsgrad. Vi formoder at genkende forskellige populationer af patienter, hver med et specifikt immunologisk mønster. Det kan afvige med hensyn til cytokiner, opløselige faktorers serumniveau og immuncelleaktivitet både i det medfødte og det erhvervede. Beviset for en rolle af disse immunologiske fænomener i patogenesen af ​​Covid-19 er baser for implementering af terapeutiske immunmodulerende behandlinger. Derudover kunne definitionen af ​​en immunologisk risikoprofil skræddersy etablerede terapier til hver type patient.

Studieoversigt

Status

Ukendt

Betingelser

Intervention / Behandling

Detaljeret beskrivelse

Ifølge den medicinske hypotese, som protokollen er baseret på, kunne unge mennesker drage fordel af en funktionel tilpasning af medfødte immunceller induceret gennem epigenetisk omprogrammering og især en allerede eksisterende "delvis specifik" immunitet over for samfundsvira forårsaget af "tilskuere". effekt" af forudgående vaccinationer. I denne undersøgelse vil vi udforske de vigtigste forskelle, der eksisterer blandt patienter inficeret med SARS-CoV-2, som oplever sygdommen i forskellig grad af sværhedsgrad. Vi formoder at genkende forskellige populationer af patienter, hver med et specifikt immunologisk mønster. Det kan afvige med hensyn til cytokiner, opløselige faktorers serumniveau og immuncelleaktivitet både i det medfødte og det erhvervede.

Data vil blive indsamlet ved hjælp af 3 tilgange:

  • En eksperimentel analyse, for klynger af patienter, for at studere det medfødte immunrespons og for at identificere de genetiske profiler.
  • En epidemiologisk analyse med henblik på at identificere patienternes vaccinationshistorie;
  • En klinisk analyse for at påvise den immunologiske profil;

Til den specifikke analyse, for at studere det medfødte immunrespons og for at identificere de genetiske profiler, vil forskere fra det perifere blod analysere NK-celler, monocytter, CD4 og CD8 T-celler fra begge grupper: raske patienter (testet negativ for SARS-CoV -2) og syge patienter i undergrupperne (AS 19, PAU19, POL19, ARD19).

Fra forskellige grupper af patienter vil blodprøver (10-15 ml) blive udtaget i EDTA-rør, centrifugeret ved 360 g i 10 minutter for at opnå plasma, som vil blive opbevaret ved -80 °C til efterfølgende analyse for cytokiner og kemokiner af interesse. ved ELISA (IL-lb, IL-6, TNF, IFN-a, IL-10, IL-12, CCL2 og CXCL10) ved afslutningen af ​​tilmeldingen.

Cellepelleterne vil blive bragt tilbage til det oprindelige volumen med PBS og fortyndet 1:1 (v/v) og derefter udsat for en tæthedsgradientstratificering med Ficoll Histopaque-1077 ved 500 g i 30 minutter. De perifere blodmononukleære celler (PBMC'er) afledt af den hvide ring vil blive opsamlet, vasket to gange i PBS og derefter brugt til efterfølgende eksperimenter ved anvendelse af et flowcytometerassay (REFF). In vitro-kulturen ved hjælp af PBMC'er kan variere fra ex vivo 1 dag til et par dage, og cellerne vil blive opretholdt i RPMI 1640-medium, suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS), 2 mM l-glutamin, 100 U/mL penicillin og 100 μg/mL streptomycin (P/S), ved 37°C, 5 % CO2.

For at udføre ex vivo fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) fænotypeanalyse, vil 2,5x105 friske totale PBMC'er pr. FACS-rør blive farvet i 30 minutter ved 4°C med monoklonale antistoffer (mAbs) som følger: CD3-PerCP, CD56-APC , CD16-FITC, NKG2A-PE, NKG2C-PE, NKGD2-PE, DNAM-1-PE, CD25-PE, CD69-PE. Efter Forward/Side Scatter-indstilling vil NK-celler blive identificeret i to celleundersæt, dvs. som CD3- og CD56dim CD16+-celler (CD56dim NK-celler, hovedundergruppen, ca. 90%) og CD3- og CD56bright CD16-/lave celler ( CD56bright NK-celler, den mindre delmængde, omkring 10 %). Andre markørers ekspression vil blive evalueret på begge undergrupper af gatede celler.

Til ex vivo FACS-evaluering af monocyt-fænotypeanalyse vil 2,5x105 friske totale PBMC'er pr. FACS-rør blive farvet i 30 minutter ved 4°C med mAbs som følger: CD45-APC, CD14-FITC og CD16-V450, PE-CD209, PE-CD80. Efter Forward/Side Scatter-indstilling vil monocytter blive identificeret i tre undergrupper, dvs. som CD14+ og CD16- celler (hovedundergruppen, ca. 90%), CD14+ CD16+ (den mindre delmængde, ca. 10%) og CD14-/lav CD16+ (den anden mindre delmængde).

Vi vil også evaluere fænotype for CD4 og CD8 T-celler og CD4/CD8 T-forhold ved hjælp af 2x105 friske totale PBMC'er, som tidligere beskrevet, med følgende mAbs: CD3-PerCP, CD4-APC, CD8-V450 samt T-regulatorisk (Treg) ) celler, som CD3-PerCP, CD4-APC, CD25-PE.

PBMC'er vil også blive stimuleret in vitro i 4 timer med forskellige typer stimuli, såsom LPS (genkendt af TLR4), poly(I:C) (genkendt af TLR3), poly (I:C) plus IL-2 plus IL-12 og phorbolmyristatacetat (PMA) plus ionomycin i nærvær af monensin og brefeldin. Denne procedure vil gøre det muligt at studere specifik cytokin/kemokinproduktion fra NK-celler og monocytter ved at bruge et FACS intracellulært assay, som beskrevet tidligere (REFF). For NK-celler vil vi måle IFN-a-PE, TNF-PE, CCL2-PE, CXCL10-PE og CD107a-PE (degranulationsmarkør). For monocytter vil vi undersøge: IL-6-PE, TNFa-PE, IL-12-PE, CXCL10-PE (M1-type pro-inflammatoriske markører) og TGFb-PE, IL-10-PE, CCL18-PE (M2) -type antiinflammatoriske markører) Når mængden af ​​PBMC'er er tilstrækkelig, vil andre funktionelle in vitro-tests på NK-celler og monocytter blive sat op. Især vil PBMC'er blive undersøgt for 4 timers NK-celledegranulering/cytotoksisk funktion mod erytroleukæmisk K562-cellelinje, der vurderer overflade CD107a-PE ved hjælp af et flow-cytofluorimetrisk assay (REFF).

Når mængden af ​​PBMC'er er tilstrækkelig, vil monocytter blive oprenset ved hjælp af anti-CD14 mikroperler med magnetisk separator og NK celler med RosetteSep kit for at opnå >90% oprensede cellepopulationer.

Oprensede monocytter og oprenset NK kunne holdes adskilt eller sammen i kultur under anvendelse af RPMI 1640-medium med 10% FBS og suppleret med henholdsvis M-CSF og IL-2, stimuleret med forskellige stimuli (se ovenfor), og derefter kontrolleret for intracellulære cytokiner /kemokiner af interesse (se ovenfor). Samtidig kunne supernatanterne (konditioneret medium, CM) høstes ved afslutningen af ​​in vitro inkubationskultur og vurderes for cytokiner/kemokiner ved hjælp af ELISA (IL-1b, IL-6, TNFa, IFNa, IL-10, IL- 12, CXCL10).

De 4-5 dages in vitro-kultur af monocytter vil blive yderligere stimuleret 24 timer med LPS plus IFNg (M1-stimulus) eller (IL-4) (M2-stimulus) for at undersøge makrofagpolarisering, der studerer overflade-M1-markører (TNF, CXCL10) eller M2-markører (IL-10, CCL18) for at kontrollere forekomsten af ​​makrofagpolarisering i forskellige grupper af Covid-19-patienter.

Den epidemiologiske analyse vil blive udført ved at integrere både vaccinationshistorik og de data, der dagligt indsamles efter hospitalsindlæggelse. ATS Insubria-arkiver vil levere manglende data.

I betragtning af den immunologiske profil vil patienter med Covid-19 blive testet til rutineundersøgelser og følgende:

  • lymfocytimmunfænotypning;
  • bestemmelse af C3- og C4-komplementfraktioners aktivitet;
  • immunoglobulin (IgG, IgM, IgA, IgE) serumniveau;
  • serumproteinelektroforese;
  • Angiotensin Converting Enzyme (ACE) serumniveau;
  • CMV (Citomegalovirus) serologisk test;
  • IL-6 serumniveau.

Undersøgelsestype

Observationel

Tilmelding (Forventet)

150

Kontakter og lokationer

Dette afsnit indeholder kontaktoplysninger for dem, der udfører undersøgelsen, og oplysninger om, hvor denne undersøgelse udføres.

Studiesteder

  • Italien
      • Varese, Italien, 21100
        • Rekruttering
        • ATS Insubria
        • Kontakt:
        • Ledende efterforsker:
          • Giuseppe Ietto, MD
        • Ledende efterforsker:
          • Lorenzo Mortara, Professor
        • Underforsker:
          • Domenico Iovino, MD
        • Underforsker:
          • Daniela Dalla Gasperina, Professor
        • Ledende efterforsker:
          • Giulio Carcano, Professor
        • Underforsker:
          • Andreina Baj, MD
        • Underforsker:
          • Walter Ageno, Professor
        • Underforsker:
          • Francesco Acquati, Professor
        • Underforsker:
          • Angelo Genoni, Dr
        • Underforsker:
          • Denisa Baci, PhD
        • Underforsker:
          • Matteo Gallazzi, PhD
        • Underforsker:
          • Annarosaria De Vito, PhD
        • Underforsker:
          • Elisa Monti, MD
        • Underforsker:
          • Andrea Vigezzi, MD
        • Underforsker:
          • Caterina Franchi, MD
        • Underforsker:
          • Valentina Iori, MD
        • Underforsker:
          • Federica Masci, MD

Deltagelseskriterier

Forskere leder efter personer, der passer til en bestemt beskrivelse, kaldet berettigelseskriterier. Nogle eksempler på disse kriterier er en persons generelle helbredstilstand eller tidligere behandlinger.

Berettigelseskriterier

Aldre berettiget til at studere

18 år og ældre (Voksen, Ældre voksen)

Tager imod sunde frivillige

Ingen

Køn, der er berettiget til at studere

Alle

Prøveudtagningsmetode

Ikke-sandsynlighedsprøve

Studiebefolkning

Patienterne testede positive for SARS-CoV-2

Beskrivelse

Inklusionskriterier:

  • Alder: ≥ 18 år
  • SARS-CoV-2 dokumenteret infektion

Ekskluderingskriterier:

  • Afvisning af at underskrive aftalen (informeret samtykke);
  • Manglende evne til at underskrive aftalen;
  • HIV, HCV, HBV (positiv for HBsAg) infektion.

Studieplan

Dette afsnit indeholder detaljer om studieplanen, herunder hvordan undersøgelsen er designet, og hvad undersøgelsen måler.

Hvordan er undersøgelsen tilrettelagt?

Design detaljer

  • Observationsmodeller: Kun etui
  • Tidsperspektiver: Fremadrettet

Kohorter og interventioner

Gruppe / kohorte
Intervention / Behandling
Testet positiv for SARS-CoV-2
Patienter, testet positive for SARS-CoV-2, vil blive rekrutteret i E.R. af "Ospedale Di Circolo - ASST Settelaghi" Teaching Hospital i Varese.
Diagnostisk test: Undersøgelse af immunmedierede mekanismer hos patienter testet positive for SARS-CoV-2
Fænotypisk og funktionel analyse af monocytter og NK-celler

Hvad måler undersøgelsen?

Primære resultatmål

Resultatmål
Foranstaltningsbeskrivelse
Tidsramme
Immuncellers aktivitet
Tidsramme: 6 måneder
Forskernes hypotese er, at monocytter, NK, CD4 OG CD8 T-celler hos patienter med alvorlig infektion med SARS-CoV-2 viser en svækkelse af deres funktion: celler afslører en overvældende hyperaktivitet, der fremkalder en patologisk inflammatorisk reaktion med en massiv produktion af proinflammatorisk cytokin, ødem og lungefibrose.
6 måneder

Sekundære resultatmål

Resultatmål
Foranstaltningsbeskrivelse
Tidsramme
Beskyttende faktorer og nye terapeutiske strategier
Tidsramme: 6 måneder
De sekundære mål er at korrelere kliniske data og vaccinationshistorie med laboratorieimmunmønster for at identificere beskyttende faktorer for Covid 19 og åbne veje for nye terapeutiske strategier.
6 måneder

Samarbejdspartnere og efterforskere

Det er her, du vil finde personer og organisationer, der er involveret i denne undersøgelse.

Sponsor

Università degli Studi dell'Insubria

Efterforskere

  • Studiestol: Giulio Carcano, Professor, Università degli Studi dell'Insubria
  • Ledende efterforsker: Giuseppe Ietto, M.D., Università degli Studi dell'Insubria
  • Ledende efterforsker: Lorenzo Mortara, Professor, Università degli Studi dell'Insubria

Publikationer og nyttige links

Den person, der er ansvarlig for at indtaste oplysninger om undersøgelsen, leverer frivilligt disse publikationer. Disse kan handle om alt relateret til undersøgelsen.

Generelle publikationer

Datoer for undersøgelser

Disse datoer sporer fremskridtene for indsendelser af undersøgelsesrekord og resumeresultater til ClinicalTrials.gov. Studieregistreringer og rapporterede resultater gennemgås af National Library of Medicine (NLM) for at sikre, at de opfylder specifikke kvalitetskontrolstandarder, før de offentliggøres på den offentlige hjemmeside.

Studer store datoer

Studiestart (Faktiske)

27. april 2020

Primær færdiggørelse (Forventet)

30. juni 2020

Studieafslutning (Forventet)

31. oktober 2020

Datoer for studieregistrering

Først indsendt

3. maj 2020

Først indsendt, der opfyldte QC-kriterier

3. maj 2020

Først opslået (Faktiske)

5. maj 2020

Opdateringer af undersøgelsesjournaler

Sidste opdatering sendt (Faktiske)

5. maj 2020

Sidste opdatering indsendt, der opfyldte kvalitetskontrolkriterier

3. maj 2020

Sidst verificeret

1. maj 2020

Mere information

Begreber relateret til denne undersøgelse

Yderligere relevante MeSH-vilkår

Andre undersøgelses-id-numre

  • 67/2020

Plan for individuelle deltagerdata (IPD)

Planlægger du at dele individuelle deltagerdata (IPD)?

Uafklaret

Lægemiddel- og udstyrsoplysninger, undersøgelsesdokumenter

Studerer et amerikansk FDA-reguleret lægemiddelprodukt

Ingen

Studerer et amerikansk FDA-reguleret enhedsprodukt

Ingen

Disse oplysninger blev hentet direkte fra webstedet clinicaltrials.gov uden ændringer. Hvis du har nogen anmodninger om at ændre, fjerne eller opdatere dine undersøgelsesoplysninger, bedes du kontakte register@clinicaltrials.gov. Så snart en ændring er implementeret på clinicaltrials.gov, vil denne også blive opdateret automatisk på vores hjemmeside .

Kliniske forsøg med COVID-19

Søg i lignende forsøg

Sponsorer og samarbejdspartnere

Medicinske tilstande

Narkotikainterventioner

CROs by country

CROs in Serbia

Betingelser

Sjældne sygdomme

Narkotikainterventioner

Kosttilskud

Sponsor / samarbejdspartnere

Placeringer

Abonner