Monosyyttien ja NK-solujen aktiivisuus Covid-19-potilailla
Tutkimus immuunivälitteisistä mekanismeista potilailla, jotka on testattu SARS-CoV-2:lle: Monosyyttien ja NK-solujen fenotyyppinen ja toiminnallinen analyysi Covid 19 -tartunnan saaneiden potilaiden veressä
SARS-CoV-2 kuuluu beetakoronavirusperheeseen ja sen tartuntareitti ja oireet seuraavat kaikkien yhteisössä hankittujen koronavirusten kulkua. Suurin ero uuteen koronavirukseen on korkeampi kuolleisuus, joka on noin 3 %.
Vain yli 50-vuotiailla kuolleisuus on yli 1 %, kun taas 40-vuotiailla alle 0,4 %. Alle 10-vuotiaiden lasten kuolemantapauksia ei ole toistaiseksi ilmoitettu. Kuolleisuus on lähes kaksinkertainen miehillä kuin naisilla. Tämä kuolleisuuden jakautuminen tartunnan saaneiden potilaiden iän mukaan voitiin vain osittain selittää suuren iän lisäksi muista liitännäissairauksista. Itse asiassa potilaiden, joilla ei ole aiempaa sairautta, kuolleisuusaste on 0,9 %.
Vaikeiden sairauksien lähes nollaluku lapsilla ja yleensä alle 40-vuotiailla potilailla on täysin selittämätön. Vauva, lapset ja nuoret voivat saada tartunnan, mutta infektio on nopeasti itsestään ohi tai oireeton. Vanhemmat potilaat kärsivät vakavasta keuhkovauriosta myöhään saapuvan immuunivasteen seurauksena.
Mahdollinen selitys näille ilmiöille voisi olla jokin, joka varmistaa kyvyn saada nopea vaste SARS-CoV-2:een nuoremmilla ihmisillä riippumatta itse viruksen uutuudesta.
Vaikuttaa siltä, että nuoremmat ihmiset ovat jo herkistyneet viruksen antigeeneille ilman aikaisempaa kosketusta.
Tämä immuniteetti ei ole todella spesifinen, vaan "osittain spesifinen" monille viruksen antigeeneille, mutta pystyy kuitenkin rajoittamaan infektiota organismissa. Jokin stimuloi immuunijärjestelmää ja hajotti immuniteettia yhä useampia läsnä olevia antigeenejä vastaan. Lapset ovat ikäryhmä, joka altistuu enimmäkseen kaikille yhteisössä leviäville viruksille.
Tämä immuniteetti ei ole jatkuvaa, vaan häviää vähitellen. Se suojaa kahden vuoden iästä, kun hypoteettinen stimulaatio tapahtuu, viidenteen vuosikymmeneen sen hitaan laskun vuoksi.
Ainoa ulkoinen stimulaatio, jonka terveet ihmiset saavat, ovat rokotteet. Kaikki rokotukset ja erityisesti tetaaniset, kurkkumätätoksoidit ja inaktivoidut bakteerit, kuten hinkuyskä, voivat stimuloida immuunijärjestelmää. Ne kehittävät spesifisen immuniteetin, mutta tuottavat myös itävän immuniteetin kuljetuksessa olevia antigeenejä, kuten koronaviruksia ja muita yhteisössä kiertäviä viruksia vastaan.
Kehittynyt immuniteetti antaa jonkin verran suojaa useita virusinfektioita vastaan vuosia, kunnes luonnollinen haihtuu.
Viidennen vuosikymmenen jälkeen immuniteetti on hitaampi palautua ja aktivoitua uudelleen. Lisäksi elinsiirtojen vastaanottajat ja HIV-tartunnan saaneet potilaat, joiden immuunijärjestelmä on estynyt, ei yllättäen näytä kärsivän SARS-CoV-2-infektion pahimmista komplikaatioista. Immuunijärjestelmän epätasapainolla voi olla keskeinen rooli virusreaktion aikana, mikä rajoittaa liiallisen tulehduksen tuhoisia seurauksia.
Protokollan perustana olevan lääketieteellisen hypoteesin mukaan nuoret voivat hyötyä epigeneettisen uudelleenohjelmoinnin indusoimasta synnynnäisten immuunisolujen toiminnallisesta sopeutumisesta ja erityisesti olemassa olevasta "osittain spesifisesta" immuniteetista "sivullisen katsojan" aiheuttamia yhteisön viruksia vastaan. aikaisempien rokotusten vaikutuksesta. Tässä tutkimuksessa tutkimme tärkeimpiä eroja SARS-CoV-2-tartunnan saaneiden potilaiden välillä, jotka kokevat sairauden eri vakavuusasteella. Oletetaan, että tunnistamme erilaisia potilaspopulaatioita, joista jokaisella on erityinen immunologinen malli. Se voi erota sytokiinien, liukoisten tekijöiden seerumitason ja immuunisolujen aktiivisuuden suhteen sekä synnynnäisessä että hankitussa osassa. Todisteet näiden immunologisten ilmiöiden roolista Covid-19:n patogeneesissä ovat perusta terapeuttisten immunomoduloivien hoitojen toteuttamiselle. Lisäksi immunologisen riskiprofiilin määrittely voisi räätälöidä vakiintuneet hoidot kunkin potilastyypin mukaan.
Tutkimuksen yleiskatsaus
Tila
Yksityiskohtainen kuvaus
Protokollan perustana olevan lääketieteellisen hypoteesin mukaan nuoret voivat hyötyä epigeneettisen uudelleenohjelmoinnin indusoimasta synnynnäisten immuunisolujen toiminnallisesta sopeutumisesta ja erityisesti olemassa olevasta "osittain spesifisesta" immuniteetista "sivullisen katsojan" aiheuttamia yhteisön viruksia vastaan. aikaisempien rokotusten vaikutuksesta. Tässä tutkimuksessa tutkimme tärkeimpiä eroja SARS-CoV-2-tartunnan saaneiden potilaiden välillä, jotka kokevat sairauden eri vakavuusasteella. Oletetaan, että tunnistamme erilaisia potilaspopulaatioita, joista jokaisella on erityinen immunologinen malli. Se voi erota sytokiinien, liukoisten tekijöiden seerumitason ja immuunisolujen aktiivisuuden suhteen sekä synnynnäisessä että hankitussa osassa.
Tiedot kerätään käyttämällä kolmea lähestymistapaa:
- Kokeellinen analyysi potilasryhmille luontaisen immuunivasteen tutkimiseksi ja geneettisten profiilien tunnistamiseksi.
- Epidemiologinen analyysi potilaiden rokotushistorian tunnistamiseksi;
- Kliininen analyysi immunologisen profiilin havaitsemiseksi;
Spesifistä analyysiä varten, synnynnäisen immuunivasteen tutkimiseksi ja geneettisten profiilien tunnistamiseksi, tutkijat analysoivat molempien ryhmien perifeerisestä verestä NK-soluja, monosyyttejä, CD4- ja CD8-T-soluja: terveitä potilaita (SARS-CoV-testi negatiivinen -2) ja alaryhmien sairaat potilaat (AS 19, PAU19, POL19, ARD19).
Eri potilasryhmistä otetaan verinäytteitä (10-15 ml) EDTA-putkiin, sentrifugoidaan 360 g:llä 10 minuuttia plasman saamiseksi, jota se varastoidaan -80 °C:ssa myöhempää sytokiinien ja kemokiinien analysointia varten. ELISA:lla (IL-1b, IL-6, TNF, IFN-a, IL-10, IL-12, CCL2 ja CXCL10) ilmoittautumisen lopussa.
Solupelletit palautetaan alkuperäiseen tilavuuteen PBS:llä ja laimennetaan 1:1 (tilavuus/tilavuus), ja sitten ne altistetaan tiheysgradienttikerrokselle Ficoll Histopaque-1077:llä 500 g:ssa 30 minuutin ajan. Valkoisesta renkaasta peräisin olevat perifeerisen veren mononukleaariset solut (PBMC:t) kerätään, pestään kahdesti PBS:ssä ja käytetään sitten seuraaviin kokeisiin käyttämällä virtaussytometrimääritystä (REFF). PBMC:itä käyttävä in vitro -viljelmä voi vaihdella ex vivo yhdestä päivästä muutamaan päivään, ja soluja ylläpidetään RPMI 1640 -elatusaineessa, jota on täydennetty 10 % naudan sikiön seerumilla (FBS), 2 mM l-glutamiinilla, 100 U/ml penisilliiniä. ja 100 µg/ml streptomysiiniä (P/S), 37 °C:ssa, 5 % CO2.
Ex vivo fluoresenssiaktivoidun solulajittelun (FACS) fenotyyppianalyysin suorittamiseksi 2,5 x 105 tuoretta kokonais-PBMC:tä FACS-putkea kohti värjätään 30 minuutin ajan 4 °C:ssa monoklonaalisilla vasta-aineilla (mAb:t) seuraavasti: CD3-PerCP, CD56-APC , CD16-FITC, NKG2A-PE, NKG2C-PE, NKGD2-PE, DNAM-1-PE, CD25-PE, CD69-PE. Forward/Side Scatter -asetuksen jälkeen NK-solut tunnistetaan kahteen solualaryhmään, eli CD3- ja CD56dim CD16+ -soluiksi (CD56dim NK-solut, pääosaryhmä, noin 90 %), ja CD3- ja CD56bright CD16-/low -soluiksi ( CD56-kirkkaat NK-solut, pieni alajoukko, noin 10 %). Muiden markkerien ilmentyminen arvioidaan molemmissa avainnettujen solujen alajoukoissa.
Monosyyttien fenotyyppianalyysin ex vivo FACS-arviointia varten 2,5 x 105 tuoretta kokonais-PBMC:tä FACS-putkea kohti värjätään 30 minuutin ajan 4 °C:ssa mAb:illa seuraavasti: CD45-APC, CD14-FITC ja CD16-V450, PE-CD209, PE-CD80. Forward/Side Scatter -asetuksen jälkeen monosyytit tunnistetaan kolmeen alaryhmään, eli CD14+- ja CD16-soluiksi (pääosajoukko, noin 90 %), CD14+ CD16+:ksi (pieni alaryhmä, noin 10 %) ja CD14-/matala CD16+-soluiksi. (toinen pieni osajoukko).
Arvioimme myös CD4- ja CD8-T-solujen fenotyypin ja CD4/CD8-T-suhteen käyttämällä 2 x 105 tuoretta kokonais-PBMC:tä, kuten aiemmin on kuvattu, seuraavilla mAb:illa: CD3-PerCP, CD4-APC, CD8-V450 sekä T-säätely (Treg) ) soluja, kuten CD3-PerCP, CD4-APC, CD25-PE.
PBMC:itä stimuloidaan myös in vitro 4 tunnin ajan erityyppisillä ärsykkeillä, kuten LPS (tunnistaa TLR4), poly(I:C) (tunnistaa TLR3), poly (I:C) plus IL-2 plus IL-12 ja forbolimyristaattiasetaatti (PMA) sekä ionomysiini monensiinin ja brefeldiinin läsnä ollessa. Tämä menettely mahdollistaa spesifisen sytokiini/kemokiinituotannon tutkimisen NK-soluista ja monosyyteistä käyttämällä solunsisäistä FACS-määritystä, kuten aiemmin on kuvattu (REFF). NK-solujen osalta mittaamme IFN-a-PE, TNF-PE, CCL2-PE, CXCL10-PE ja CD107a-PE (degranulaatiomarkkeri). Monosyyttien osalta tutkimme: IL-6-PE, TNFa-PE, IL-12-PE, CXCL10-PE (M1-tyypin pro-inflammatoriset markkerit) ja TGFb-PE, IL-10-PE, CCL18-PE (M2) -tyypin anti-inflammatoriset markkerit) Aina kun PBMC:iden määrä on riittävä, tehdään muita toiminnallisia in vitro -testejä NK-soluille ja monosyyteille. Erityisesti PBMC:itä tutkitaan 4 tunnin NK-solujen degranulaatio/sytotoksisen toiminnan suhteen kohti erytroleukeemista K562-solulinjaa arvioimalla pinnan CD107a-PE käyttämällä virtaussytofluorimetristä määritystä (REFF).
Aina kun PBMC:iden määrä on riittävä, monosyytit puhdistetaan käyttämällä anti-CD14-mikrohelmiä magneettierottimella ja NK-soluja RosetteSep-pakkauksella, jotta saadaan >90 % puhdistettuja solupopulaatioita.
Puhdistettuja monosyyttejä ja puhdistettua NK:ta voitiin pitää erillään tai yhdessä viljelmässä käyttämällä RPMI 1640 -elatusainetta, jossa oli 10 % FBS:ää, ja täydennettynä vastaavasti M-CSF:llä ja IL-2:lla, stimuloimalla eri ärsykkeillä (katso edellä), ja sitten tarkistaa solunsisäisten sytokiinien varalta. /kiinnostavat kemokiinit (katso edellä). Samanaikaisesti supernatantit (käsitelty väliaine, CM) voitiin kerätä talteen in vitro -inkubointiviljelmän lopussa ja arvioida sytokiinit/kemokiinit ELISA:lla (IL-1b, IL-6, TNFa, IFNa, IL-10, IL- 12, CXCL10).
Monosyyttien 4-5 päivän in vitro -viljelmää stimuloidaan edelleen 24 tuntia LPS:llä plus IFNg:llä (M1-ärsyke) tai (IL-4) (M2-ärsyke) makrofagien polarisaation tutkimiseksi tutkimalla pinnan M1-markkereita (TNF, CXCL10) tai M2-markkereita. (IL-10, CCL18) makrofagien polarisaation esiintyvyyden tarkistamiseksi eri Covid-19-potilasryhmissä.
Epidemiologinen analyysi tehdään yhdistämällä sekä rokotushistoria että päivittäin sairaalahoidon jälkeen kerätyt tiedot. ATS Insubrian arkisto tarjoaa puuttuvat tiedot.
Immunologisen profiilin perusteella Covid-19-potilaat testataan rutiinitutkimuksia ja seuraavia varten:
- lymfosyyttien immunofenotyypitys;
- C3- ja C4-komplementtifraktioiden aktiivisuuden määrittäminen;
- immunoglobuliinin (IgG, IgM, IgA, IgE) seerumitason;
- seerumiproteiinien elektroforeesi;
- Angiotensiiniä konvertoivan entsyymin (ACE) seerumin taso;
- CMV (citomegalovirus) serologinen testi;
- IL-6 seerumin taso.
Opintotyyppi
Ilmoittautuminen (Odotettu)
Yhteystiedot ja paikat
Opiskelupaikat
-
-
-
Varese, Italia, 21100
- Rekrytointi
- ATS Insubria
-
Ottaa yhteyttä:
- Giuseppe Ietto, M.D.
- Puhelinnumero: +393398758024
- Sähköposti: giuseppe.ietto@gmail.com
-
Päätutkija:
- Giuseppe Ietto, MD
-
Päätutkija:
- Lorenzo Mortara, Professor
-
Alatutkija:
- Domenico Iovino, MD
-
Alatutkija:
- Daniela Dalla Gasperina, Professor
-
Päätutkija:
- Giulio Carcano, Professor
-
Alatutkija:
- Andreina Baj, MD
-
Alatutkija:
- Walter Ageno, Professor
-
Alatutkija:
- Francesco Acquati, Professor
-
Alatutkija:
- Angelo Genoni, Dr
-
Alatutkija:
- Denisa Baci, PhD
-
Alatutkija:
- Matteo Gallazzi, PhD
-
Alatutkija:
- Annarosaria De Vito, PhD
-
Alatutkija:
- Elisa Monti, MD
-
Alatutkija:
- Andrea Vigezzi, MD
-
Alatutkija:
- Caterina Franchi, MD
-
Alatutkija:
- Valentina Iori, MD
-
Alatutkija:
- Federica Masci, MD
-
-
Osallistumiskriteerit
Kelpoisuusvaatimukset
Opintokelpoiset iät
Hyväksyy terveitä vapaaehtoisia
Sukupuolet, jotka voivat opiskella
Näytteenottomenetelmä
Tutkimusväestö
Kuvaus
Sisällyttämiskriteerit:
- Ikä: ≥ 18
- SARS-CoV-2 dokumentoitu infektio
Poissulkemiskriteerit:
- Kieltäytyminen sopimuksen allekirjoittamisesta (tietoinen suostumus);
- Kyvyttömyys allekirjoittaa sopimusta;
- HIV, HCV, HBV (positiivinen HBsAg:lle) -infektio.
Opintosuunnitelma
Miten tutkimus on suunniteltu?
Suunnittelun yksityiskohdat
- Havaintomallit: Vain tapaus
- Aikanäkymät: Tulevaisuuden
Kohortit ja interventiot
Ryhmä/Kohortti |
Interventio / Hoito |
|---|---|
|
Testi positiivinen SARS-CoV-2:lle
Potilaat, joiden SARS-CoV-2-testi on positiivinen, rekrytoidaan Varesen Ospedale Di Circolo - ASST Settelaghi -opetussairaalaan E.R.:hen.
|
Monosyyttien ja NK-solujen fenotyyppinen ja toiminnallinen analyysi
|
Mitä tutkimuksessa mitataan?
Ensisijaiset tulostoimenpiteet
Tulosmittaus |
Toimenpiteen kuvaus |
Aikaikkuna |
|---|---|---|
|
Immuunisolujen toiminta
Aikaikkuna: 6 kuukautta
|
Tutkijoiden hypoteesi on, että monosyytit, NK-, CD4- JA CD8-T-solut potilailla, joilla on vakava SARS-CoV-2-infektio, osoittavat toiminnan heikkenemistä: solut paljastavat ylivoimaisen yliaktiivisuuden, joka aiheuttaa patologisen tulehdusvasteen, joka tuottaa massiivisesti tulehdusta edistävä sytokiini, turvotus ja keuhkofibroosi.
|
6 kuukautta
|
Toissijaiset tulostoimenpiteet
Tulosmittaus |
Toimenpiteen kuvaus |
Aikaikkuna |
|---|---|---|
|
Suojatekijät ja uudet hoitostrategiat
Aikaikkuna: 6 kuukautta
|
Toissijaisina tavoitteina on korreloida kliinisiä tietoja ja rokotushistoriaa laboratorion immuunijärjestelmän kanssa Covid 19:n suojaavien tekijöiden tunnistamiseksi ja uusien hoitostrategioiden avaamiseksi.
|
6 kuukautta
|
Yhteistyökumppanit ja tutkijat
Sponsori
Tutkijat
- Opintojen puheenjohtaja: Giulio Carcano, Professor, Università degli Studi dell'Insubria
- Päätutkija: Giuseppe Ietto, M.D., Università degli Studi dell'Insubria
- Päätutkija: Lorenzo Mortara, Professor, Università degli Studi dell'Insubria
Julkaisuja ja hyödyllisiä linkkejä
Yleiset julkaisut
- Netea MG, Dominguez-Andres J, Barreiro LB, Chavakis T, Divangahi M, Fuchs E, Joosten LAB, van der Meer JWM, Mhlanga MM, Mulder WJM, Riksen NP, Schlitzer A, Schultze JL, Stabell Benn C, Sun JC, Xavier RJ, Latz E. Defining trained immunity and its role in health and disease. Nat Rev Immunol. 2020 Jun;20(6):375-388. doi: 10.1038/s41577-020-0285-6. Epub 2020 Mar 4.
- Benn CS, Netea MG, Selin LK, Aaby P. A small jab - a big effect: nonspecific immunomodulation by vaccines. Trends Immunol. 2013 Sep;34(9):431-9. doi: 10.1016/j.it.2013.04.004. Epub 2013 May 14.
- Ietto G. SARS - CoV-2: Reasons of epidemiology of severe ill disease cases and therapeutic approach using trivalent vaccine (tetanus, diphtheria and Bordetella pertussis). Med Hypotheses. 2020 Aug;141:109779. doi: 10.1016/j.mehy.2020.109779. Epub 2020 Apr 22.
- Murray PJ, Allen JE, Biswas SK, Fisher EA, Gilroy DW, Goerdt S, Gordon S, Hamilton JA, Ivashkiv LB, Lawrence T, Locati M, Mantovani A, Martinez FO, Mege JL, Mosser DM, Natoli G, Saeij JP, Schultze JL, Shirey KA, Sica A, Suttles J, Udalova I, van Ginderachter JA, Vogel SN, Wynn TA. Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 2014 Jul 17;41(1):14-20. doi: 10.1016/j.immuni.2014.06.008.
- Noonan DM, De Lerma Barbaro A, Vannini N, Mortara L, Albini A. Inflammation, inflammatory cells and angiogenesis: decisions and indecisions. Cancer Metastasis Rev. 2008 Mar;27(1):31-40. doi: 10.1007/s10555-007-9108-5.
- Parisi L, Gini E, Baci D, Tremolati M, Fanuli M, Bassani B, Farronato G, Bruno A, Mortara L. Macrophage Polarization in Chronic Inflammatory Diseases: Killers or Builders? J Immunol Res. 2018 Jan 14;2018:8917804. doi: 10.1155/2018/8917804. eCollection 2018.
- Bruno A, Focaccetti C, Pagani A, Imperatori AS, Spagnoletti M, Rotolo N, Cantelmo AR, Franzi F, Capella C, Ferlazzo G, Mortara L, Albini A, Noonan DM. The proangiogenic phenotype of natural killer cells in patients with non-small cell lung cancer. Neoplasia. 2013 Feb;15(2):133-42. doi: 10.1593/neo.121758.
- Bruno A, Bassani B, D'Urso DG, Pitaku I, Cassinotti E, Pelosi G, Boni L, Dominioni L, Noonan DM, Mortara L, Albini A. Angiogenin and the MMP9-TIMP2 axis are up-regulated in proangiogenic, decidual NK-like cells from patients with colorectal cancer. FASEB J. 2018 Oct;32(10):5365-5377. doi: 10.1096/fj.201701103R. Epub 2018 May 15.
- Bassani B, Baci D, Gallazzi M, Poggi A, Bruno A, Mortara L. Natural Killer Cells as Key Players of Tumor Progression and Angiogenesis: Old and Novel Tools to Divert Their Pro-Tumor Activities into Potent Anti-Tumor Effects. Cancers (Basel). 2019 Apr 1;11(4):461. doi: 10.3390/cancers11040461.
- Morandi F, Horenstein AL, Chillemi A, Quarona V, Chiesa S, Imperatori A, Zanellato S, Mortara L, Gattorno M, Pistoia V, Malavasi F. CD56brightCD16- NK Cells Produce Adenosine through a CD38-Mediated Pathway and Act as Regulatory Cells Inhibiting Autologous CD4+ T Cell Proliferation. J Immunol. 2015 Aug 1;195(3):965-72. doi: 10.4049/jimmunol.1500591. Epub 2015 Jun 19.
- Ietto G, Mortara L, Dalla Gasperina D, Iovino D, Azzi L, Baj A, Ageno W, Genoni AP, Acquati F, Gallazzi M, Spina G, Coco G, Pierin F, Noonan D, Vigezzi A, Monti E, Iori V, Masci F, Franchi C, Di Saverio S, Carcano G. Immune-Mediated Mechanisms in Patients Testing Positive for SARS-CoV-2: Protocol for a Multianalysis Study. JMIR Res Protoc. 2022 Jan 25;11(1):e29892. doi: 10.2196/29892.
Opintojen ennätyspäivät
Opi tärkeimmät päivämäärät
Opiskelun aloitus (Todellinen)
Ensisijainen valmistuminen (Odotettu)
Opintojen valmistuminen (Odotettu)
Opintoihin ilmoittautumispäivät
Ensimmäinen lähetetty
Ensimmäinen toimitettu, joka täytti QC-kriteerit
Ensimmäinen Lähetetty (Todellinen)
Tutkimustietojen päivitykset
Viimeisin päivitys julkaistu (Todellinen)
Viimeisin lähetetty päivitys, joka täytti QC-kriteerit
Viimeksi vahvistettu
Lisää tietoa
Tähän tutkimukseen liittyvät termit
Muita asiaankuuluvia MeSH-ehtoja
Muut tutkimustunnusnumerot
- 67/2020
Yksittäisten osallistujien tietojen suunnitelma (IPD)
Aiotko jakaa yksittäisten osallistujien tietoja (IPD)?
Lääke- ja laitetiedot, tutkimusasiakirjat
Tutkii yhdysvaltalaista FDA sääntelemää lääkevalmistetta
Tutkii yhdysvaltalaista FDA sääntelemää laitetuotetta
Nämä tiedot haettiin suoraan verkkosivustolta clinicaltrials.gov ilman muutoksia. Jos sinulla on pyyntöjä muuttaa, poistaa tai päivittää tutkimustietojasi, ota yhteyttä register@clinicaltrials.gov. Heti kun muutos on otettu käyttöön osoitteessa clinicaltrials.gov, se päivitetään automaattisesti myös verkkosivustollemme .