Tato stránka byla automaticky přeložena a přesnost překladu není zaručena. Podívejte se prosím na anglická verze pro zdrojový text.

Aktivita monocytů a NK buněk u pacientů s Covid-19

3. května 2020 aktualizováno: Ietto Giuseppe, Università degli Studi dell'Insubria

Studie imunitně zprostředkovaných mechanismů u pacientů pozitivně testovaných na SARS-CoV-2: Fenotypová a funkční analýza monocytů a NK buněk v krvi subjektů postižených Covid 19

SARS-CoV-2 patří do rodiny beta-koronavirů a jeho cesta přenosu a příznaky jsou stejné jako u všech komunitně získaných koronavirů. Hlavním rozdílem nového koronaviru je vyšší úmrtnost, která se pohybuje kolem 3 %.

Úmrtnost je nad 1 % pouze u pacientů starších 50 let, zatímco do 40 let je pod 0,4 %. K dnešnímu dni nejsou hlášeny žádné smrtelné případy u dětí mladších 10 let. Úmrtnost je téměř dvojnásobná u mužů než u žen. Toto rozložení úmrtnosti podle věku infikovaných pacientů bylo možné jen částečně připsat vedle vysokého věku dalším komorbiditám. Ve skutečnosti však pacienti bez preexistujících onemocnění mají úmrtnost 0,9 %.

Téměř nulová míra závažných onemocnění u dětí a obecně u pacientů mladších 40 let je zcela nevysvětlitelná. Kojenci, děti a mladí lidé mohou být infikováni, ale infekce rychle odezní sama nebo bez příznaků. Starší pacienti podstupují vážné poškození plic v důsledku imunitní reakce, která přichází pozdě.

Možným vysvětlením těchto jevů by mohlo být něco, co zajistí schopnost rychlé reakce na SARS-CoV-2 u mladších lidí nezávisle na novosti samotného viru.

Zdá se, že mladší lidé jsou již citliví na antigeny viru bez předchozího kontaktu.

Tato imunita není ve skutečnosti specifická, ale "částečně specifická" pro mnoho antigenů viru, nicméně je schopna omezit infekci v organismu. Něco stimulovalo imunitní systém a to rozptýlilo imunitu proti dalším a dalším přítomným antigenům. Děti jsou věkovou skupinou, která je nejvíce vystavena všem virům šířícím se v komunitě.

Tato imunita není trvalá, ale postupně mizí. Chrání od dvou let věku, kdy dochází k hypotetické stimulaci, do páté dekády kvůli jejímu pomalému poklesu.

Jedinou vnější stimulací, kterou zdraví lidé dostávají, jsou vakcíny. Všechna očkování a zvláště tetanické, difterické toxoidy a inaktivované bakterie jako pertussis mohou stimulovat imunitní systém. Rozvíjejí specifickou imunitu, ale vytvářejí také klíčící imunitu proti antigenům v tranzitu, jako jsou koronaviry a další viry cirkulující v komunitě.

Vyvinutá imunita poskytuje určitou ochranu proti mnohočetným virovým infekcím po celá léta, dokud přirozené nevymizí.

Po páté dekádě je tato imunita pomalejší na vyvolání a reaktivaci. Navíc se neočekávaně nezdá, že by příjemci transplantátu a pacienti infikovaní HIV, kteří mají inhibovaný imunitní systém, netrpěli nejhoršími komplikacemi infekce SARS-CoV-2. Nerovnováha imunitního systému by mohla hrát klíčovou roli během reakce na virus, omezující destruktivní důsledky nadměrného zánětu.

Podle lékařské hypotézy, na které je protokol založen, by mladí lidé mohli těžit z funkční adaptace vrozených imunitních buněk vyvolaných epigenetickým přeprogramováním a zejména z již existující „částečně specifické“ imunity vůči komunitním virům způsobeným „přihlížejícím účinek“ předchozích očkování. V této studii prozkoumáme hlavní rozdíly existující mezi pacienty infikovanými SARS-CoV-2, kteří trpí onemocněním v různé míře závažnosti. Předpokládáme, že rozpoznáváme různé populace pacientů, z nichž každý má specifický imunologický vzorec. Může se lišit z hlediska cytokinů, hladiny rozpustných faktorů v séru a aktivity imunitních buněk jak vrozeného kompartmentu, tak získaného. Důkazy o roli těchto imunologických jevů v patogenezi COVID-19 jsou základem pro realizaci terapeutické imunomodulační léčby. Kromě toho by definice imunologického rizikového profilu mohla přizpůsobit zavedené terapie každému druhu pacienta.

Přehled studie

Postavení

Neznámý

Podmínky

Intervence / Léčba

Detailní popis

Podle lékařské hypotézy, na které je protokol založen, by mladí lidé mohli těžit z funkční adaptace vrozených imunitních buněk vyvolaných epigenetickým přeprogramováním a zejména z již existující „částečně specifické“ imunity vůči komunitním virům způsobeným „přihlížejícím účinek“ předchozích očkování. V této studii prozkoumáme hlavní rozdíly existující mezi pacienty infikovanými SARS-CoV-2, kteří trpí onemocněním v různé míře závažnosti. Předpokládáme, že rozpoznáváme různé populace pacientů, z nichž každý má specifický imunologický vzorec. Může se lišit z hlediska cytokinů, hladiny rozpustných faktorů v séru a aktivity imunitních buněk jak vrozeného kompartmentu, tak získaného.

Data budou shromažďována pomocí 3 přístupů:

  • Experimentální analýza pro skupiny pacientů ke studiu vrozené imunitní reakce a identifikaci genetických profilů.
  • Epidemiologická analýza za účelem identifikace očkovací historie pacientů;
  • Klinická analýza k detekci imunologického profilu;

Pro specifickou analýzu, pro studium vrozené imunitní reakce a pro identifikaci genetických profilů, budou vědci analyzovat z periferní krve NK buňky, monocyty, CD4 a CD8 T buňky obou skupin: zdravé pacienty (negativní test na SARS-CoV -2) a nemocní pacienti podskupin (AS 19, PAU19, POL19, ARD19).

Od různých skupin pacientů budou vzorky krve (10-15 ml) odebrány do zkumavek s EDTA, centrifugovány při 360 g po dobu 10 minut, aby se získala plazma, která bude uchovávána při -80 °C pro následnou analýzu na cytokiny a chemokiny, které jsou předmětem zájmu. pomocí ELISA (IL-lb, IL-6, TNF, IFN-a, IL-10, IL-12, CCL2 a CXCL10) na konci zařazení.

Buněčné pelety se vrátí na původní objem pomocí PBS a zředí se 1:1 (obj./obj.) a poté se podrobí stratifikaci s hustotním gradientem s Ficoll Histopaque-1077 při 500 g po dobu 30 minut. Mononukleární buňky periferní krve (PBMC) odvozené z bílého prstence budou shromážděny, dvakrát promyty v PBS a poté použity pro následné experimenty pomocí testu průtokového cytometru (REFF). In vitro kultura využívající PBMC se může lišit od ex vivo 1 dne až po několik dní a buňky budou udržovány v médiu RPMI 1640, doplněném 10% fetálním bovinním sérem (FBS), 2 mM l-glutaminu, 100 U/ml penicilinu a 100 ug/ml streptomycinu (P/S), při 37 °C, 5 % CO2.

Pro provedení ex vivo analýzy fenotypu fluorescenčně aktivovaného buněčného třídiče (FACS) se 2,5 x 105 čerstvých celkových PBMC na zkumavku FACS barví po dobu 30 minut při 4 °C monoklonálními protilátkami (mAbs) následovně: CD3-PerCP, CD56-APC , CD16-FITC, NKG2A-PE, NKG2C-PE, NKGD2-PE, DNAM-1-PE, CD25-PE, CD69-PE. Po nastavení Forward/Side Scatter budou NK buňky identifikovány do dvou buněčných podskupin, tj. jako CD3- a CD56dim CD16+ buňky (CD56dim NK buňky, hlavní podskupina, asi 90 %) a CD3- a CD56bright CD16-/low buňky ( CD56bright NK buňky, menší podskupina, asi 10 %). Exprese dalších markerů bude hodnocena na obou podskupinách gatovaných buněk.

Pro ex vivo FACS hodnocení analýzy fenotypu monocytů se 2,5x105 čerstvých celkových PBMC na zkumavku FACS barví po dobu 30 minut při 4 °C pomocí mAb následovně: CD45-APC, CD14-FITC a CD16-V450, PE-CD209, PE-CD80. Po nastavení Forward/Side Scatter budou monocyty identifikovány do tří podskupin, tj. jako buňky CD14+ a CD16- (hlavní podskupina, asi 90 %), CD14+ CD16+ (vedlejší podskupina, asi 10 %) a CD14-/low CD16+ (druhá vedlejší podmnožina).

Budeme také hodnotit fenotyp pro CD4 a CD8 T buňky a poměr CD4/CD8 T pomocí 2x105 čerstvých celkových PBMC, jak bylo popsáno dříve, s následujícími mAb: CD3-PerCP, CD4-APC, CD8-V450 a také T regulační (Treg ) buňky, jako CD3-PerCP, CD4-APC, CD25-PE.

PBMC budou také in vitro stimulovány po dobu 4 hodin různými typy stimulů, jako je LPS (rozpoznaný TLR4), poly(I:C) (rozpoznaný TLR3), poly (I:C) plus IL-2 plus IL-12 a forbol myristát acetát (PMA) plus ionomycin v přítomnosti monensinu a brefeldinu. Tento postup umožní studium specifické produkce cytokinů/chemokinů z NK buněk a monocytů pomocí intracelulárního testu FACS, jak bylo popsáno dříve (REFF). U NK buněk budeme měřit IFN-a-PE, TNF-PE, CCL2-PE, CXCL10-PE a CD107a-PE (degranulační marker). U monocytů budeme vyšetřovat: IL-6-PE, TNFa-PE, IL-12-PE, CXCL10-PE (prozánětlivé markery typu M1) a TGFb-PE, IL-10-PE, CCL18-PE (M2 -typ protizánětlivých markerů) Kdykoli je množství PBMC dostatečné, budou nastaveny další funkční in vitro testy na NK buňkách a monocytech. Konkrétně budou PBMC studovány na 4h degranulaci/cytotoxickou funkci NK buněk vůči erytroleukemické buněčné linii K562 hodnotící povrchový CD107a-PE pomocí průtokového cytofluorimetrického testu (REFF).

Kdykoli je množství PBMC dostatečné, monocyty budou purifikovány pomocí anti-CD14 mikrokuliček s magnetickým separátorem a NK buněk pomocí sady RosetteSep, aby se získalo >90 % purifikovaných buněčných populací.

Purifikované monocyty a purifikované NK mohly být udržovány odděleně nebo společně v kultuře s použitím média RPMI 1640 s 10% FBS a doplněny M-CSF a IL-2, v daném pořadí, stimulovány různými stimuly (viz výše), a poté kontrolovány na intracelulární cytokiny /chemokiny zájmu (viz výše). Současně mohly být supernatanty (kondicionované médium, CM) sklizeny na konci in vitro inkubační kultury a hodnoceny na cytokiny/chemokiny pomocí ELISA (IL-1b, IL-6, TNFa, IFNa, IL-10, IL- 12, CXCL10).

4-5denní in vitro kultura monocytů bude dále stimulována 24 hodin LPS plus IFNg (stimul M1) nebo (IL-4) (stimul M2), aby se prozkoumala polarizace makrofágů studiem povrchových markerů M1 (TNF, CXCL10) nebo markerů M2 (IL-10, CCL18) ke kontrole prevalence polarizace makrofágů u různých skupin pacientů s Covid-19.

Epidemiologická analýza bude provedena integrací jak historie očkování, tak údajů denně shromažďovaných po přijetí do nemocnice. Archivy ATS Insubria poskytnou chybějící data.

S ohledem na imunologický profil budou pacienti s Covid-19 testováni na rutinní vyšetření a následující:

  • imunofenotypizace lymfocytů;
  • stanovení aktivity frakcí komplementu C3 a C4;
  • hladina imunoglobulinu (IgG, IgM, IgA, IgE) v séru;
  • elektroforéza sérových proteinů;
  • hladina angiotensin konvertujícího enzymu (ACE) v séru;
  • CMV (Citomegalovirus) sérologický test;
  • Hladina IL-6 v séru.

Typ studie

Pozorovací

Zápis (Očekávaný)

150

Kontakty a umístění

Tato část poskytuje kontaktní údaje pro ty, kteří studii provádějí, a informace o tom, kde se tato studie provádí.

Studijní místa

  • Itálie
      • Varese, Itálie, 21100
        • Nábor
        • ATS Insubria
        • Kontakt:
        • Vrchní vyšetřovatel:
          • Giuseppe Ietto, MD
        • Vrchní vyšetřovatel:
          • Lorenzo Mortara, Professor
        • Dílčí vyšetřovatel:
          • Domenico Iovino, MD
        • Dílčí vyšetřovatel:
          • Daniela Dalla Gasperina, Professor
        • Vrchní vyšetřovatel:
          • Giulio Carcano, Professor
        • Dílčí vyšetřovatel:
          • Andreina Baj, MD
        • Dílčí vyšetřovatel:
          • Walter Ageno, Professor
        • Dílčí vyšetřovatel:
          • Francesco Acquati, Professor
        • Dílčí vyšetřovatel:
          • Angelo Genoni, Dr
        • Dílčí vyšetřovatel:
          • Denisa Baci, PhD
        • Dílčí vyšetřovatel:
          • Matteo Gallazzi, PhD
        • Dílčí vyšetřovatel:
          • Annarosaria De Vito, PhD
        • Dílčí vyšetřovatel:
          • Elisa Monti, MD
        • Dílčí vyšetřovatel:
          • Andrea Vigezzi, MD
        • Dílčí vyšetřovatel:
          • Caterina Franchi, MD
        • Dílčí vyšetřovatel:
          • Valentina Iori, MD
        • Dílčí vyšetřovatel:
          • Federica Masci, MD

Kritéria účasti

Výzkumníci hledají lidi, kteří odpovídají určitému popisu, kterému se říká kritéria způsobilosti. Některé příklady těchto kritérií jsou celkový zdravotní stav osoby nebo předchozí léčba.

Kritéria způsobilosti

Věk způsobilý ke studiu

18 let a starší (Dospělý, Starší dospělý)

Přijímá zdravé dobrovolníky

Ne

Pohlaví způsobilá ke studiu

Všechno

Metoda odběru vzorků

Vzorek nepravděpodobnosti

Studijní populace

Pacienti byli pozitivně testováni na SARS-CoV-2

Popis

Kritéria pro zařazení:

  • Věk: ≥ 18
  • Prokázaná infekce SARS-CoV-2

Kritéria vyloučení:

  • Odmítnutí podepsat dohodu (informovaný souhlas);
  • Neschopnost podepsat smlouvu;
  • Infekce HIV, HCV, HBV (pozitivní na HBsAg).

Studijní plán

Tato část poskytuje podrobnosti o studijním plánu, včetně toho, jak je studie navržena a co studie měří.

Jak je studie koncipována?

Detaily designu

  • Observační modely: Pouze případ
  • Časové perspektivy: Budoucí

Kohorty a intervence

Skupina / kohorta
Intervence / Léčba
Testováno pozitivně na SARS-CoV-2
Pacienti s pozitivním testem na SARS-CoV-2 budou přijati do E.R. fakultní nemocnice „Ospedale Di Circolo – ASST Settelaghi“ ve Varese.
Diagnostický test: Studie imunitně zprostředkovaných mechanismů u pacientů pozitivně testovaných na SARS-CoV-2
Fenotypová a funkční analýza monocytů a NK buněk

Co je měření studie?

Primární výstupní opatření

Měření výsledku
Popis opatření
Časové okno
Aktivita imunitních buněk
Časové okno: 6 měsíců
Hypotéza vědců je, že monocyty, NK, CD4 A CD8 T buňky u pacientů s těžkou infekcí SARS-CoV-2 vykazují poruchu své funkce: buňky vykazují silnou hyperaktivitu, která vyvolává patologickou zánětlivou reakci s masivní produkcí prozánětlivý cytokin, edém a plicní fibróza.
6 měsíců

Sekundární výstupní opatření

Měření výsledku
Popis opatření
Časové okno
Ochranné faktory a nové terapeutické strategie
Časové okno: 6 měsíců
Sekundárními cíli je korelovat klinická data a historii očkování s laboratorním imunitním vzorem za účelem identifikace ochranných faktorů pro Covid 19 a otevření cest pro nové terapeutické strategie.
6 měsíců

Spolupracovníci a vyšetřovatelé

Zde najdete lidi a organizace zapojené do této studie.

Sponzor

Università degli Studi dell'Insubria

Vyšetřovatelé

  • Studijní židle: Giulio Carcano, Professor, Università degli Studi dell'Insubria
  • Vrchní vyšetřovatel: Giuseppe Ietto, M.D., Università degli Studi dell'Insubria
  • Vrchní vyšetřovatel: Lorenzo Mortara, Professor, Università degli Studi dell'Insubria

Publikace a užitečné odkazy

Osoba odpovědná za zadávání informací o studiu tyto publikace poskytuje dobrovolně. Mohou se týkat čehokoli, co souvisí se studiem.

Obecné publikace

Termíny studijních záznamů

Tato data sledují průběh záznamů studie a předkládání souhrnných výsledků na ClinicalTrials.gov. Záznamy ze studií a hlášené výsledky jsou před zveřejněním na veřejné webové stránce přezkoumány Národní lékařskou knihovnou (NLM), aby se ujistily, že splňují specifické standardy kontroly kvality.

Hlavní termíny studia

Začátek studia (Aktuální)

27. dubna 2020

Primární dokončení (Očekávaný)

30. června 2020

Dokončení studie (Očekávaný)

31. října 2020

Termíny zápisu do studia

První předloženo

3. května 2020

První předloženo, které splnilo kritéria kontroly kvality

3. května 2020

První zveřejněno (Aktuální)

5. května 2020

Aktualizace studijních záznamů

Poslední zveřejněná aktualizace (Aktuální)

5. května 2020

Odeslaná poslední aktualizace, která splnila kritéria kontroly kvality

3. května 2020

Naposledy ověřeno

1. května 2020

Více informací

Termíny související s touto studií

Další relevantní podmínky MeSH

Další identifikační čísla studie

  • 67/2020

Plán pro data jednotlivých účastníků (IPD)

Plánujete sdílet data jednotlivých účastníků (IPD)?

Nerozhodný

Informace o lécích a zařízeních, studijní dokumenty

Studuje lékový produkt regulovaný americkým FDA

Ne

Studuje produkt zařízení regulovaný americkým úřadem FDA

Ne

Tyto informace byly beze změn načteny přímo z webu clinicaltrials.gov. Máte-li jakékoli požadavky na změnu, odstranění nebo aktualizaci podrobností studie, kontaktujte prosím register@clinicaltrials.gov. Jakmile bude změna implementována na clinicaltrials.gov, bude automaticky aktualizována i na našem webu .

Klinické studie na COVID-19

Prohledejte podobné pokusy

Sponzoři a spolupracovníci

Zdravotní podmínky

Drogové intervence

CROs by country

CROs in Armenia

Podmínky

Vzácné nemoci

Drogové intervence

Doplňky stravy

Sponzor / Spolupracovníci

Místa

Předplatit