Actividad de monocitos y células NK en pacientes con Covid-19
Estudio de Mecanismos Inmunes en Pacientes con SARS-CoV-2 Positivo: Análisis Fenotípico y Funcional de Monocitos y Células NK en Sangre de Sujetos Afectados por Covid 19
El SARS-CoV-2 pertenece a la familia de los beta-coronavirus y su ruta de transmisión y síntomas son similares a los de todos los coronavirus adquiridos en la comunidad. La principal diferencia del nuevo Coronavirus es la mayor tasa de mortalidad, que ronda el 3%.
La tasa de mortalidad es superior al 1% solo para pacientes mayores de 50 años, mientras que hasta los 40 años es inferior al 0,4%. No se declaran víctimas mortales entre los niños menores de 10 años a la fecha. La tasa de mortalidad es casi el doble para los hombres que para las mujeres. Esta distribución de la tasa de mortalidad según la edad de los pacientes infectados podría atribuirse solo parcialmente a otras comorbilidades además de la edad avanzada. De hecho, los pacientes sin condiciones preexistentes tienen sin embargo una tasa de letalidad del 0,9%.
La tasa casi nula de enfermedad grave en niños y, en general, en pacientes menores de 40 años es bastante inexplicable. Los bebés, los niños y los jóvenes pueden infectarse, pero la infección se autolimita rápidamente o no presenta síntomas. Los pacientes mayores sufren una lesión pulmonar grave como consecuencia de una respuesta inmunitaria tardía.
La posible explicación de estos fenómenos podría ser algo que asegure la capacidad de una respuesta rápida al SARS-CoV-2 en personas más jóvenes, independientemente de la novedad del virus en sí.
Parece ser que los jóvenes ya están sensibilizados a los antígenos del virus sin un contacto previo.
Esta inmunidad no es realmente específica, sino "parcialmente específica" para muchos antígenos del virus, pero capaz de limitar la infección en el organismo. Algo estimuló el sistema inmunológico y dispersó la inmunidad contra cada vez más antígenos presentes. Los niños son el grupo de edad más expuesto a todos los virus que circulan en la comunidad.
Esta inmunidad no es persistente sino que se desvanece progresivamente. Protege desde los dos años, cuando se produce el hipotético estímulo, hasta la quinta década por su lento descenso.
La única estimulación externa que reciben las personas sanas son las vacunas. Todas las vacunas y especialmente la tetánica, toxoides diftéricos y bacterias inactivadas como la tos ferina podrían estimular el sistema inmunológico. Desarrollan la inmunidad específica pero generan también una inmunidad germinal contra antígenos en tránsito, como coronavirus y otros virus circulantes en la comunidad.
La inmunidad desarrollada brinda cierta protección contra la infección viral múltiple durante años hasta que desaparece de forma natural.
Después de la quinta década, esa inmunidad tarda más en recuperarse y reactivarse. Además, los receptores de trasplantes y los pacientes infectados por el VIH, que tienen un sistema inmunológico inhibido, inesperadamente, no parecen sufrir las peores complicaciones de la infección por SARS-CoV-2. Un desequilibrio del sistema inmunitario podría desempeñar un papel fundamental durante la reacción al virus, limitando las consecuencias destructivas de la inflamación excesiva.
Según la hipótesis médica en la que se basa el protocolo, los jóvenes podrían beneficiarse de una adaptación funcional de las células inmunitarias innatas inducida a través de la reprogramación epigenética y, en especial, de una inmunidad preexistente "parcialmente específica" a los virus comunitarios provocados por "transeúntes". efecto" de las vacunas precedentes. En este estudio exploraremos las principales diferencias existentes entre los pacientes infectados por SARS-CoV-2 que experimentan la enfermedad en diferente grado de severidad. Suponemos reconocer diferentes poblaciones de pacientes, cada una con un patrón inmunológico específico. Podría diferir en términos de citocinas, nivel sérico de factores solubles y actividad de células inmunitarias tanto del compartimento innato como del adquirido. La prueba de un papel de estos fenómenos inmunológicos en la patogénesis de Covid-19 son bases para la implementación de tratamientos inmunomoduladores terapéuticos. Además, la definición de un perfil de riesgo inmunológico podría adaptar las terapias establecidas a cada tipo de paciente.
Descripción general del estudio
Estado
Intervención / Tratamiento
Descripción detallada
Según la hipótesis médica en la que se basa el protocolo, los jóvenes podrían beneficiarse de una adaptación funcional de las células inmunitarias innatas inducida a través de la reprogramación epigenética y, en especial, de una inmunidad preexistente "parcialmente específica" a los virus comunitarios provocados por "transeúntes". efecto" de las vacunas precedentes. En este estudio exploraremos las principales diferencias existentes entre los pacientes infectados por SARS-CoV-2 que experimentan la enfermedad en diferente grado de severidad. Suponemos reconocer diferentes poblaciones de pacientes, cada una con un patrón inmunológico específico. Podría diferir en términos de citocinas, nivel sérico de factores solubles y actividad de células inmunitarias tanto del compartimento innato como del adquirido.
Los datos se recopilarán utilizando 3 enfoques:
- Un análisis experimental, por conglomerados de pacientes, para estudiar la respuesta inmune innata e identificar los perfiles genéticos.
- Un análisis epidemiológico, a fin de identificar el historial de vacunación de los pacientes;
- Un análisis clínico, para detectar el perfil inmunológico;
Para el análisis específico, para estudiar la respuesta inmune innata e identificar los perfiles genéticos, los científicos analizarán, a partir de sangre periférica, células NK, monocitos, células T CD4 y CD8 de ambos grupos: pacientes sanos (negativos para SARS-CoV -2) y enfermos de los subgrupos (AS 19, PAU19, POL19, ARD19).
De diferentes grupos de pacientes, se extraerán muestras de sangre (10-15 mL) en tubos con EDTA, se centrifugarán a 360 g durante 10 minutos para obtener plasma que se almacenará a -80 °C para su posterior análisis de citocinas y quimiocinas de interés. por ELISA (IL-1b, IL-6, TNF, IFN-a, IL-10, IL-12, CCL2 y CXCL10) al final de la inscripción.
Los sedimentos celulares se devolverán al volumen inicial con PBS y se diluirán 1:1 (v/v), y luego se someterán a una estratificación en gradiente de densidad con Ficoll Histopaque-1077, a 500 g durante 30 minutos. Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) derivadas del anillo blanco se recolectarán, se lavarán dos veces en PBS y luego se usarán para experimentos posteriores usando un ensayo de citómetro de flujo (REFF). El cultivo in vitro con PBMC puede variar desde ex vivo 1 día hasta unos pocos días, y las células se mantendrán en medio RPMI 1640, complementado con suero fetal bovino (FBS) al 10 %, l-glutamina 2 mM, 100 U/ml de penicilina y 100 μg/mL de estreptomicina (P/S), a 37°C, 5% CO2.
Para realizar un análisis de fenotipo del clasificador de células activadas por fluorescencia (FACS) ex vivo, se tiñerán 2,5x105 de PBMC totales frescas por tubo FACS durante 30 minutos a 4 °C con anticuerpos monoclonales (mAb) de la siguiente manera: CD3-PerCP, CD56-APC , CD16-FITC, NKG2A-PE, NKG2C-PE, NKGD2-PE, DNAM-1-PE, CD25-PE, CD69-PE. Después de la configuración de dispersión frontal/lateral, las células NK se identificarán en dos subconjuntos de células, es decir, como células CD3- y CD56dim CD16+ (células NK CD56dim, el subconjunto principal, alrededor del 90 %) y células CD3- y CD56bright CD16-/low ( células NK CD56bright, el subconjunto menor, alrededor del 10%). La expresión de otros marcadores se evaluará en ambos subconjuntos de celdas cerradas.
Para la evaluación FACS ex vivo del análisis del fenotipo de los monocitos, se tiñerán 2,5x105 de PBMC totales frescas por tubo FACS durante 30 minutos a 4 °C con mAbs de la siguiente manera: CD45-APC, CD14-FITC y CD16-V450, PE-CD209, PE-CD80. Después de la configuración de dispersión frontal/lateral, los monocitos se identificarán en tres subconjuntos, es decir, como células CD14+ y CD16- (el subconjunto principal, alrededor del 90 %), CD14+ CD16+ (el subconjunto menor, alrededor del 10 %) y CD14-/CD16+ bajo. (el otro subconjunto menor).
También evaluaremos el fenotipo de las células T CD4 y CD8 y la proporción de T CD4/CD8 usando 2x105 de PBMC totales frescas, como se describió anteriormente, con los siguientes mAb: CD3-PerCP, CD4-APC, CD8-V450, así como T regulador (Treg ) células, como CD3-PerCP, CD4-APC, CD25-PE.
Las PBMC también se estimularán in vitro durante 4 h con diferentes tipos de estímulos, como LPS (reconocido por TLR4), poli(I:C) (reconocido por TLR3), poli(I:C) más IL-2 más IL-12 y acetato de miristato de forbol (PMA) más ionomicina en presencia de monensina y brefeldina. Este procedimiento permitirá estudiar la producción específica de citoquinas/quimioquinas a partir de células NK y monocitos mediante el uso de un ensayo intracelular FACS, como se describió anteriormente (REFF). Para las células NK, mediremos IFN-a-PE, TNF-PE, CCL2-PE, CXCL10-PE y CD107a-PE (marcador de desgranulación). Para monocitos investigaremos: IL-6-PE, TNFa-PE, IL-12-PE, CXCL10-PE (marcadores proinflamatorios tipo M1) y TGFb-PE, IL-10-PE, CCL18-PE (M2 -marcadores antiinflamatorios tipo) Siempre que la cantidad de PBMCs sea suficiente, se establecerán otros ensayos funcionales in vitro sobre células NK y monocitos. En particular, las PBMC se estudiarán durante 4 h para la desgranulación de células NK/función citotóxica hacia la línea celular eritroleucémica K562 que evalúa la superficie CD107a-PE mediante un ensayo de citofluorimetría de flujo (REFF).
Siempre que la cantidad de PBMCs sea suficiente, se purificarán los monocitos utilizando microesferas anti-CD14 con separador magnético y células NK con el kit RosetteSep para obtener >90% de poblaciones celulares purificadas.
Los monocitos purificados y la NK purificada podrían mantenerse separados o juntos en cultivo usando medio RPMI 1640 con FBS al 10 %, y suplementados con M-CSF e IL-2, respectivamente, estimulados con diferentes estímulos (ver arriba) y luego verificados en busca de citocinas intracelulares. /quimiocinas de interés (ver arriba). Al mismo tiempo, los sobrenadantes (medio acondicionado, CM) se pudieron recolectar al final del cultivo de incubación in vitro y se evaluaron las citoquinas/quimioquinas usando ELISA (IL-1b, IL-6, TNFa, IFNa, IL-10, IL- 12, CXCL10).
El cultivo in vitro de monocitos de 4-5 días se estimulará adicionalmente 24 h con LPS más IFNg (estímulo M1) o (IL-4) (estímulo M2) para investigar la polarización de macrófagos estudiando marcadores M1 de superficie (TNF, CXCL10) o marcadores M2 (IL-10, CCL18) para verificar la prevalencia de polarización de macrófagos en diferentes grupos de pacientes con Covid-19.
El análisis epidemiológico se realizará integrando tanto el historial vacunal como los datos recogidos diariamente tras el ingreso hospitalario. Los archivos de ATS Insubria proporcionarán los datos faltantes.
Considerando el perfil inmunológico, a los pacientes con Covid-19 se les realizarán exámenes de rutina y los siguientes:
- inmunofenotipado de linfocitos;
- determinación de la actividad de las fracciones del complemento C3 y C4;
- nivel sérico de inmunoglobulina (IgG, IgM, IgA, IgE);
- electroforesis de proteínas séricas;
- nivel sérico de la enzima convertidora de angiotensina (ECA);
- Prueba de serología CMV (Citomegalovirus);
- Nivel sérico de IL-6.
Tipo de estudio
Inscripción (Anticipado)
Contactos y Ubicaciones
Ubicaciones de estudio
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Varese, Italia, 21100
- Reclutamiento
- ATS Insubria
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Contacto:
- Giuseppe Ietto, M.D.
- Número de teléfono: +393398758024
- Correo electrónico: giuseppe.ietto@gmail.com
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Investigador principal:
- Giuseppe Ietto, MD
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Investigador principal:
- Lorenzo Mortara, Professor
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Sub-Investigador:
- Domenico Iovino, MD
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Sub-Investigador:
- Daniela Dalla Gasperina, Professor
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Investigador principal:
- Giulio Carcano, Professor
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Sub-Investigador:
- Andreina Baj, MD
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Sub-Investigador:
- Walter Ageno, Professor
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Sub-Investigador:
- Francesco Acquati, Professor
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Sub-Investigador:
- Angelo Genoni, Dr
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Sub-Investigador:
- Denisa Baci, PhD
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Sub-Investigador:
- Matteo Gallazzi, PhD
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Sub-Investigador:
- Annarosaria De Vito, PhD
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Sub-Investigador:
- Elisa Monti, MD
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Sub-Investigador:
- Andrea Vigezzi, MD
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Sub-Investigador:
- Caterina Franchi, MD
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Sub-Investigador:
- Valentina Iori, MD
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Sub-Investigador:
- Federica Masci, MD
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Criterios de participación
Criterio de elegibilidad
Edades elegibles para estudiar
Acepta Voluntarios Saludables
Géneros elegibles para el estudio
Método de muestreo
Población de estudio
Descripción
Criterios de inclusión:
- Edad: ≥ 18
- Infección documentada por SARS-CoV-2
Criterio de exclusión:
- Negativa a la firma del contrato (consentimiento informado);
- Incapacidad para firmar el acuerdo;
- Infección por VIH, VHC, VHB (positivo a HBsAg).
Plan de estudios
¿Cómo está diseñado el estudio?
Detalles de diseño
- Modelos observacionales: Solo caso
- Perspectivas temporales: Futuro
Cohortes e Intervenciones
Grupo / Cohorte |
Intervención / Tratamiento |
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Dio positivo por SARS-CoV-2
Los pacientes que dieron positivo para SARS-CoV-2 serán reclutados en la sala de emergencias del Hospital Universitario "Ospedale Di Circolo - ASST Settelaghi" en Varese.
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Análisis fenotípico y funcional de monocitos y células NK
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¿Qué mide el estudio?
Medidas de resultado primarias
Medida de resultado |
Medida Descripción |
Periodo de tiempo |
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Actividad de las células inmunitarias
Periodo de tiempo: 6 meses
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La hipótesis de los científicos es que los monocitos, las células T NK, CD4 Y CD8, en pacientes con infección grave por SARS-CoV-2, muestran un deterioro en su función: las células revelan una hiperactividad abrumadora que provoca una respuesta inflamatoria patológica con una producción masiva de citocina proinflamatoria, edema y fibrosis pulmonar.
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6 meses
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Medidas de resultado secundarias
Medida de resultado |
Medida Descripción |
Periodo de tiempo |
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Factores protectores y nuevas estrategias terapéuticas
Periodo de tiempo: 6 meses
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Los objetivos secundarios son correlacionar los datos clínicos y el historial de vacunación con el patrón inmunológico de laboratorio para identificar factores protectores para Covid 19 y abrir caminos para nuevas estrategias terapéuticas.
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6 meses
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Colaboradores e Investigadores
Patrocinador
Investigadores
- Silla de estudio: Giulio Carcano, Professor, Università degli Studi dell'Insubria
- Investigador principal: Giuseppe Ietto, M.D., Università degli Studi dell'Insubria
- Investigador principal: Lorenzo Mortara, Professor, Università degli Studi dell'Insubria
Publicaciones y enlaces útiles
Publicaciones Generales
- Netea MG, Dominguez-Andres J, Barreiro LB, Chavakis T, Divangahi M, Fuchs E, Joosten LAB, van der Meer JWM, Mhlanga MM, Mulder WJM, Riksen NP, Schlitzer A, Schultze JL, Stabell Benn C, Sun JC, Xavier RJ, Latz E. Defining trained immunity and its role in health and disease. Nat Rev Immunol. 2020 Jun;20(6):375-388. doi: 10.1038/s41577-020-0285-6. Epub 2020 Mar 4.
- Benn CS, Netea MG, Selin LK, Aaby P. A small jab - a big effect: nonspecific immunomodulation by vaccines. Trends Immunol. 2013 Sep;34(9):431-9. doi: 10.1016/j.it.2013.04.004. Epub 2013 May 14.
- Ietto G. SARS - CoV-2: Reasons of epidemiology of severe ill disease cases and therapeutic approach using trivalent vaccine (tetanus, diphtheria and Bordetella pertussis). Med Hypotheses. 2020 Aug;141:109779. doi: 10.1016/j.mehy.2020.109779. Epub 2020 Apr 22.
- Murray PJ, Allen JE, Biswas SK, Fisher EA, Gilroy DW, Goerdt S, Gordon S, Hamilton JA, Ivashkiv LB, Lawrence T, Locati M, Mantovani A, Martinez FO, Mege JL, Mosser DM, Natoli G, Saeij JP, Schultze JL, Shirey KA, Sica A, Suttles J, Udalova I, van Ginderachter JA, Vogel SN, Wynn TA. Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 2014 Jul 17;41(1):14-20. doi: 10.1016/j.immuni.2014.06.008.
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- Morandi F, Horenstein AL, Chillemi A, Quarona V, Chiesa S, Imperatori A, Zanellato S, Mortara L, Gattorno M, Pistoia V, Malavasi F. CD56brightCD16- NK Cells Produce Adenosine through a CD38-Mediated Pathway and Act as Regulatory Cells Inhibiting Autologous CD4+ T Cell Proliferation. J Immunol. 2015 Aug 1;195(3):965-72. doi: 10.4049/jimmunol.1500591. Epub 2015 Jun 19.
- Ietto G, Mortara L, Dalla Gasperina D, Iovino D, Azzi L, Baj A, Ageno W, Genoni AP, Acquati F, Gallazzi M, Spina G, Coco G, Pierin F, Noonan D, Vigezzi A, Monti E, Iori V, Masci F, Franchi C, Di Saverio S, Carcano G. Immune-Mediated Mechanisms in Patients Testing Positive for SARS-CoV-2: Protocol for a Multianalysis Study. JMIR Res Protoc. 2022 Jan 25;11(1):e29892. doi: 10.2196/29892.
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Términos relacionados con este estudio
Términos MeSH relevantes adicionales
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- Enfermedades pulmonares
- Síndrome respiratorio agudo severo
- COVID-19
Otros números de identificación del estudio
- 67/2020
Plan de datos de participantes individuales (IPD)
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Información sobre medicamentos y dispositivos, documentos del estudio
Estudia un producto farmacéutico regulado por la FDA de EE. UU.
Estudia un producto de dispositivo regulado por la FDA de EE. UU.
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